[發(fā)明專利]計數(shù)并鑒別微生物的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010288488.4
• 申請日: 2005-05-08
• 公開（公告）號: CN101921879A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 芭芭拉·揚(yáng);安德魯·塞奇
• 申請（專利權(quán)）人: 米利波爾公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12Q1/06;C12Q1/04
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

本發(fā)明涉及一種計數(shù)并鑒別微生物的方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增該微生物的特異成分，然后根據(jù)對所擴(kuò)增的成分產(chǎn)物的測定，在具有很少或無孵育時間的單一步驟中計數(shù)膜裝置上的微生物的方法。另外，用這個方法可以鑒別所述微生物。

背景技術(shù)

確定液體例如水、食品例如汁、或藥品中有無微生物存在的常規(guī)方法是將液體過濾通過合適的膜以將液體中所存在的任何微生物都阻擋于膜的表面上。然后將膜放置于加有瓊脂或其他合適培養(yǎng)基的生長培養(yǎng)皿例如陪替培養(yǎng)皿中，然后孵育數(shù)天以容許被捕獲的微生物發(fā)展成菌落。

然后取出培養(yǎng)皿肉眼觀察，使得可以計數(shù)所存在的菌落數(shù)目。如果數(shù)目足夠多，可以進(jìn)行進(jìn)一步的測定以準(zhǔn)確地確定出存在的是什么生物體。(僅僅存在微生物這一情況本身經(jīng)常并不說明液體是不安全，且需要進(jìn)一步的工作來鑒別特殊微生物)。

根據(jù)生物體的種類、所規(guī)定的它們的孵育時間和生長速度、以及需要進(jìn)行的附加鑒別試驗、以及在工作日期間所取樣的時間和在下一個有用的工作日預(yù)備好方法的時間，該方法通常需要花費2到14天或更長時間。

最近，用于檢測和計數(shù)微生物污染的新方法已經(jīng)幫助將進(jìn)行測定所需的時間減少到約24個小時甚至更短的時間。例如，ATP生物發(fā)光法是產(chǎn)生光能產(chǎn)物的生物化學(xué)反應(yīng)；用該方法，已經(jīng)能夠以在培養(yǎng)基觀察檢測法中所需生長時間的1/3時間內(nèi)檢測并計數(shù)微生物。其他技術(shù)利用熒光分子或其他染料從膜上的各種樣品中快速地檢測微生物。也已經(jīng)用探針雜交技術(shù)在比菌落生長更短的時間內(nèi)檢測并計數(shù)膜上的微生物；在這些技術(shù)中，將已經(jīng)在膜上短時間生長的微生物與核酸探針雜交并用檢測試劑處理以檢測膜表面上所存在的任何微菌落。

US?2003-0003540-A1發(fā)展了ATP測定。它將微生物捕獲于膜上并在培養(yǎng)基中孵育微生物數(shù)小時到1天。首先進(jìn)行計數(shù)測定(通常用生物發(fā)光ATP檢測法)，然后在第二個測定中將PNA探針用于同一樣品以鑒別所發(fā)現(xiàn)的微生物。

然而這些測定方法中沒有一種能夠以與經(jīng)典的多日觀察測定方法相同的準(zhǔn)確性和特異性實時(在數(shù)小時內(nèi))檢測、計數(shù)和鑒別微生物。本發(fā)明提供了在數(shù)小時內(nèi)檢測并計數(shù)膜表面上的微生物的單一測定方法，并且也可容許在同一過程中進(jìn)行鑒別。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及一種利用膜過濾、靶向擴(kuò)增和檢測例如熒光檢測或比色檢測來檢測、計數(shù)及鑒別液體中的微生物的方法。本方法關(guān)鍵的特點是采用該擴(kuò)增步驟可以進(jìn)行快速檢測、計數(shù)并鑒別所存在的生物體。擴(kuò)增針對的是生物體中的一種選定分子例如其DNA或RNA，并將該分子的量增加到能被多種現(xiàn)有的檢測技術(shù)所檢測到的水平，以便確定所存在的靶分子。擴(kuò)增試劑包括一或多種檢測劑，所述檢測劑用于表明靶分子存在并能區(qū)分出所選定的靶在種或?qū)倩蛏踔灵T、界水平上的區(qū)別。

本發(fā)明的一個目的是提供一種計數(shù)并鑒別微生物的方法，其包括：

a)將液體樣品過濾通過適用于截留微生物的膜；

b)用一或多種含有一或多種檢測劑的試劑對膜上的微生物進(jìn)行擴(kuò)增步驟；以及

c)在存在所選定的檢測劑的情況下，確定出是否存在一或多種所截留的微生物，計數(shù)所檢測到的數(shù)目并鑒別該微生物的類型。

附圖說明

圖1顯示了本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案的示意圖。

圖2顯示了本發(fā)明的第二個優(yōu)選實施方案的示意圖。

具體實施方案

本發(fā)明涉及一種快速檢測、計數(shù)并鑒別液體或可溶性固體例如粉末、鹽、乳膏、片劑等中的微生物的方法。這些液體包括但不限定于水、飲料或奶制品例如牛奶、啤酒、酒、軟飲料、果汁、藥物、腸外營養(yǎng)、細(xì)菌空氣計數(shù)(bacterial?air?counts)等。

現(xiàn)有的快速技術(shù)可以在比在瓊脂或濾膜上生長可見菌落的經(jīng)典方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)更短的時間內(nèi)檢測并計數(shù)微生物。然而那些檢測到的生物體仍是未被鑒別的。本方法滿足了對快速檢測和計數(shù)系統(tǒng)的需要，并可以用種或?qū)俜中吞禺愄结槨⒒蚋叩拈T或綱水平的特異探針，在擴(kuò)增反應(yīng)中對所檢測到的微生物進(jìn)行鑒別。