[發(fā)明專利]體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010286383.5
• 申請(qǐng)日: 2010-09-17
• 公開（公告）號(hào): CN101979605A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 詹林盛;杜娟;梁聲強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12Q1/70;C12Q1/68;C12Q1/66;A01K67/027;A61K49/00;G01N33/569;G01N21/64
• 代理公司: 北京尚誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的動(dòng)物模型及其構(gòu)建方法，特別是涉及一種體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型及其構(gòu)建方法與其在監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs的殺傷性和非殺傷性功能中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

乙型肝炎病毒(Hepatitis?B?Virus，HBV)的感染嚴(yán)重影響著人類的健康，它能夠引起急、慢性病毒性肝炎。急性感染后，有5-10％的成年人發(fā)展為持續(xù)感染，最終可以導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝癌。目前，全球約有3.5億乙型肝炎病毒慢性感染者，盡管現(xiàn)有的疫苗能夠有效的預(yù)防乙型肝炎病毒，但不能治療已經(jīng)感染的患者。?

已有的研究表明：機(jī)體針對(duì)病毒所產(chǎn)生的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答可能是清除機(jī)體內(nèi)病毒的重要因素。目前認(rèn)為：機(jī)體內(nèi)病毒特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞清除乙肝病毒主要是通過(guò)兩條途徑實(shí)現(xiàn)：即胞毒途徑和非溶胞途徑。胞毒途徑是指機(jī)體針對(duì)HBV編碼產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異性T淋巴細(xì)胞借助其分泌的穿孔素、顆粒酶、α腫瘤壞死因子及其表面表達(dá)的Fas配體等介質(zhì)摧毀感染病毒的靶細(xì)胞。在這條途徑中特異性T淋巴細(xì)胞在清除病毒的同時(shí)也將導(dǎo)致靶細(xì)胞的裂解。非溶胞途徑是指機(jī)體針對(duì)HBV編碼產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異性T淋巴細(xì)胞通過(guò)分泌特定的細(xì)胞因子抑制HBV的復(fù)制繼而達(dá)到清除病毒的作用。這條途徑中特異性T淋巴細(xì)胞只是清除了靶細(xì)胞內(nèi)的病毒，而對(duì)靶細(xì)胞本身并無(wú)損傷。在急性HBV感染的機(jī)體內(nèi)這兩條途徑都存在。實(shí)驗(yàn)研究表明：在特異性T細(xì)胞清除病毒的過(guò)程中，非溶胞途徑可能扮演著更重要的作用。?

病毒特異性CTL清除胞內(nèi)病毒機(jī)制的研究不僅有助于更全面地認(rèn)識(shí)特異性CD8⁺T細(xì)胞在抗病毒感染方面的重要作用，也有助于更深刻地理解HBV持續(xù)感染的免疫學(xué)機(jī)制，并為HBV慢性感染的治療，如治療性疫苗的研究，提供了理論基礎(chǔ)和新的思路。目前，HBV特異性CTLs體內(nèi)抗病毒功能的測(cè)定是主要通過(guò)以下幾種間接方式進(jìn)行的：(1)通過(guò)血清ALT水平反映肝細(xì)胞的損傷；(2)通過(guò)組織化學(xué)檢測(cè)CTL的侵潤(rùn)；(3)通過(guò)血清中病毒蛋白或基因水平的減少反映CTL的殺傷活性。雖然它們是被廣泛認(rèn)可的測(cè)定抗病毒免疫的參數(shù)，但存在著低敏感度、有樣本誤差、且僅反映過(guò)去的免疫反應(yīng)?效應(yīng)等缺點(diǎn)。因此，建立一種體內(nèi)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs的殺傷性和非殺傷性功能的方法勢(shì)在必行。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種可用于體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型的構(gòu)建方法。?

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：一種體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型的構(gòu)建方法，可包括以下步驟：?

1)載體構(gòu)建：構(gòu)建包括HBV啟動(dòng)子、報(bào)告基因和HBV全基因組的重組表達(dá)載體；?

2)將步驟1)構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi)，得到體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型。?

在上述小鼠模型的構(gòu)建方法中，所述步驟1)中的HBV啟動(dòng)子為四個(gè)基本啟動(dòng)子sp1、sp2、核心啟動(dòng)子(cp)、xp與HBV兩個(gè)增強(qiáng)子(EnhI和Enh?II)的所有可能的組合；所述報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛笀?bào)告基因Fluc、GLuc等可活體成像的所有已知報(bào)告基因；所述HBV全基因組為HBV?1.2倍、1.3倍、1.5倍、2.0倍基因組。?

所述步驟1)中的HBV全基因組位于報(bào)告基因的下游。?

所述步驟1)中用于構(gòu)建重組表達(dá)載體的出發(fā)載體可為真核表達(dá)載體pGL3、pQE、或pCI-neo等，優(yōu)選為pGL3。?

以pGL3為出發(fā)載體，構(gòu)建的攜帶HBV啟動(dòng)子、Fluc報(bào)告基因和HBV全基因組的重組表達(dá)載體為pGL3-CP-Fluc-HBV1.2，其序列如序列表中序列1所示。?

上述表達(dá)載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。?

所述步驟2)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠前還包括對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行純化的步驟。?

所述步驟2)中的小鼠為雄性BALB/c小鼠(H-2^d)或C57BL/6(H-2^b)。?

所述步驟2)中的小鼠年齡為4-6周。?

所述步驟2)中的轉(zhuǎn)染方法可采用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染法，具體方法可為：取4-6周齡的雄性小鼠，稱重，將10μg重組表達(dá)載體混合于相當(dāng)于小鼠體重10％的生理鹽水，在五秒鐘內(nèi)通過(guò)尾靜脈使其快速轉(zhuǎn)染至小鼠肝臟。?