[發(fā)明專利]體內(nèi)監(jiān)測HBV特異性CTLs功能的報告基因標(biāo)記的小鼠模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010286383.5
• 申請日: 2010-09-17
• 公開（公告）號: CN101979605A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 詹林盛;杜娟;梁聲強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12Q1/70;C12Q1/68;C12Q1/66;A01K67/027;A61K49/00;G01N33/569;G01N21/64
• 代理公司: 北京尚誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

1.一種體內(nèi)監(jiān)測HBV特異性CTLs功能的報告基因標(biāo)記的小鼠模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)載體構(gòu)建：構(gòu)建包括HBV啟動子、報告基因和HBV全基因組的重組表達(dá)載體；

2)將步驟1)構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi)，得到體內(nèi)監(jiān)測HBV特異性CTLs功能的報告基因標(biāo)記的小鼠模型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟1)中的HBV啟動子為四個基本啟動子sp1、sp2、核心啟動子(cp)、xp與HBV兩個增強(qiáng)子(EnhI和EnhII)的所有可能的組合；所述報告基因為可活體成像的所有已知報告基因，如熒光素酶報告基因Fluc、GLuc；所述HBV全基因組為HBV?1.2倍、1.3倍、1.5倍、2.0倍基因組。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟1)中的HBV全基因組位于報告基因的下游。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟1)中用于構(gòu)建重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為真核表達(dá)載體pGL3、pQE或pCI-neo；以pGL3為出發(fā)載體，構(gòu)建的攜帶HBV啟動子、Fluc報告基因和HBV全基因組的重組表達(dá)載體為pGL3-CP-Fluc-HBV1.2，其序列如序列表中序列1所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟2)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠前還包括對重組表達(dá)載體進(jìn)行純化的步驟。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟2)中的小鼠為雄性BALB/c小鼠(H-2^d)或C57BL/6(H-2^b)；所述小鼠年齡為4-6周。

7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6所述的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟2)中的轉(zhuǎn)染方法采用水動力轉(zhuǎn)染法，具體方法為：取4-6周齡的雄性小鼠，稱重，將10μg重組表達(dá)載體混合于相當(dāng)于小鼠體重10％的生理鹽水，在五秒鐘內(nèi)通過尾靜脈使其快速轉(zhuǎn)染至小鼠肝臟。

8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7所述的構(gòu)建方法，其特征在于：將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠體后還包括對其進(jìn)行鑒定的步驟，具體方法為：小鼠在轉(zhuǎn)染后第1、4、7、14、28、49、和70d尾靜脈取血，檢測血清中ALT水平、HBsAg和HBVDNA的表達(dá)情況；活體熒光成像監(jiān)測報告基因表達(dá)情況；對HBsAg檢測陽性的小鼠在不同時間點(diǎn)收集肝臟組織檢測HBcAg表達(dá)情況及肝臟病理變化，以確定小鼠模型是否構(gòu)建成功；

所述模型鑒定包括如下指標(biāo)：

(1)報告基因的活體熒光成像；

(2)HBV抗原HBsAg的定量檢測；

(3)HBV抗原HBcAg的免疫組化檢測；

(4)HBV?DNA含量的實(shí)時定量PCR檢測；

(5)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的測定；

(6)肝臟病理變化-HE染色觀察。

9.權(quán)利要求8所述方法確定的體內(nèi)監(jiān)測HBV特異性CTLs功能的報告基因標(biāo)記的小鼠模型在監(jiān)測HBV特異性CTLs的殺傷性和非殺傷性功能中的應(yīng)用。

10.用權(quán)利要求1-8任一項所述方法構(gòu)建的體內(nèi)監(jiān)測HBV特異性CTLs功能的報告基因標(biāo)記的小鼠模型。