[發(fā)明專利]一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽的生產(chǎn)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010284844.5
• 申請日: 2010-09-09
• 公開（公告）號: CN102336829A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭旺明;朱晴羽;王同映
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州九源基因工程有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 徐關(guān)壽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白純化領(lǐng)域，具體地說，涉及一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)成熟肽的純化生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)

1965年，美國醫(yī)生Urist(Urist?MR.Bone：formation?byautoinduction.Science，1965，150(698)：893-899)發(fā)現(xiàn)脫鈣的骨間質(zhì)有異位成骨作用，并將新發(fā)現(xiàn)的具有誘導(dǎo)新骨形成的蛋白質(zhì)命名為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone?Morphogenetic?protein，BMP)。隨后，又發(fā)現(xiàn)了眾多的BMP，除了BMP-1，它們都是TGF-beta超家族成員，無論在基因或者蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上，還是在生物學(xué)功能上都非常相似。其中BMP-2的成骨作用研究的最多，產(chǎn)業(yè)化研究也最為廣泛。

人BMP-2全長為396個氨基酸殘基，具有成骨作用的是成熟肽，由114個氨基酸組成，在55位的天冬酰胺殘基上有糖基化位點，但是糖基化與否并不影響其生物活性。此外BMP-2疏水性很強，幾乎不溶于各種溶劑，其活性形式以二聚體形式存在，其中單體各形成3對二硫鍵，在兩個單體之間形成一對鏈間二硫鍵。二硫鍵的正確配對與否直接影響其生物活性和穩(wěn)定性。體內(nèi)外試驗證明BMP-2具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和誘導(dǎo)體外成骨的能力(Riley，EH；Lane，JM；Urist，MR，et?al.Bone?morphogenetic?protein-2：Biology?and?applications.ClinOrthop?Relat?Res.1996Mar；(324)：39-46)。但是天然的BMP-2在各種組織中的含量極低，需要采用基因重組的方法進(jìn)行大量生產(chǎn)。

在BMP-2的產(chǎn)業(yè)化研究方面，主要是真核表達(dá)載體和大腸桿菌為代表的原核表達(dá)體系兩種基因重組方案。真核表達(dá)載體國內(nèi)還未實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，1988年，wozney等(Wozney?J.M.，Rosen?V.，Celeste?A.J.etal.Novel?regulators?of?bone?formation：molecular?clones?and?activities.Science?16?December?1988；242(4885)：1528-1534.)獲得了COS-1真核表達(dá)的BMP-2；1992年，Israel?DI獲得了CHO真核表達(dá)的BMP-2(Israel?DI，Nove?J，Kerns?KM，Moutsatsos?IK，Kaufman?RJ.Expressionand?characterization?of?bone?morphogenetic?protein-2?in?Chinese?hamsterovary?cells.Growth?Factors?1992；7：139-50)；美國Medtronic?SofamorDanek公司研制的INFUSE骨移植劑和LT-CAGE腰椎融合器械在2002年7月獲得FDA批準(zhǔn)用于治療椎間盤退行性疾病(McKay?WF，Peckham?SM，Badura?JM.A?comprehensive?clinical?review?ofrecombinant?human?bone?morphogenetic?protein-2(INFUSE?Bone?Graft).Int?Orthop.2007?Dec；31(6)：729-34)；Wyeth公司開發(fā)的InductOs(TM)(rhBMP-2/ACS)于2002年9月獲得歐洲委員會(EC)的批準(zhǔn)，用于成人急性脛骨骨折的治療(Govender?S，Csimma?C，GenantHK，et?al.Recombinant?human?bone?morphogenetic?protein-2?fortreatment?of?open?tibial?fractures：a?prospective，controlled，randomizedstudy?of?four?hundred?and?fifty?patients.J?Bone?Joint?Surg?Am.2006Jun；88(6)：1258-65)。INFUSE骨移植劑和InductOs的表達(dá)體系都為CHO細(xì)胞，表達(dá)量低，生產(chǎn)成本很高，并不適合中國發(fā)展現(xiàn)狀。