[發(fā)明專利]一種R-藻藍(lán)蛋白標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010284339.0
• 申請日: 2010-09-17
• 公開（公告）號: CN101980020A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱麗萍;顏世敢;顏士勇
• 申請（專利權(quán)）人: 顏世敢
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;C07K14/405;C07K1/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種R-藻藍(lán)蛋白(R-phycocyanin，RPC)標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法，屬于免疫熒光檢測領(lǐng)域。

技術(shù)背景

免疫熒光檢測法是一種歷史悠久的標(biāo)記分析法，兼具有抗原、抗體反應(yīng)的特異性及熒光檢測的靈敏性，廣泛應(yīng)用于疾病檢測和生物學(xué)研究中。免疫熒光檢測法的特異性和敏感性依賴于熒光染料、抗體及熒光探針的屬性和質(zhì)量。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，由于血清和其他生物樣品發(fā)射波長為400～600nm的本底熒光，與常用的FITC等傳統(tǒng)熒光染料的熒光發(fā)射光譜重疊，嚴(yán)重降低熒光檢測的靈敏度，造成一段時(shí)期內(nèi)免疫熒光檢測法發(fā)展緩慢。

多管藻是生長在我國沿海地區(qū)潮間帶的特有海洋紅藻，含有大量的R-藻藍(lán)蛋白，是提取R-藻藍(lán)蛋白的比較理想的試材。R-藻藍(lán)蛋白的穩(wěn)定態(tài)為(αβ)₃，分子量約為104.9kDa，是唯一同時(shí)含有PEB和PCB的藻膽蛋白。多管藻RPC有2個(gè)吸收峰，最大吸收峰分別位于540、620nm。540nm激發(fā)光激發(fā)時(shí)室溫最大熒光發(fā)射峰位于632nm。與傳統(tǒng)的熒光染料相比，RPC具有水溶性、無毒性、摩爾消光系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率高、斯托克位移大、發(fā)射紅色熒光、背景光干擾小、不易淬滅等特點(diǎn)，因而是一類優(yōu)秀的熒光染料。

RPC用于免疫熒光檢測需要將其與抗體或抗抗體交聯(lián)制備熒光探針，RPC與抗體交聯(lián)得率低，造成RPC熒光標(biāo)記物生產(chǎn)成本居高不下，成為限制其應(yīng)用的瓶頸因素。本發(fā)明選擇溫和型的異型雙功能化學(xué)交聯(lián)劑SPDP將RPC與抗抗體液相化學(xué)交聯(lián)制備通用型熒光抗抗體，通過優(yōu)化交聯(lián)劑濃度既保證了交聯(lián)效率又不影響熒光亮度和抗體活性，成功制備出RPC標(biāo)記的熒光二抗，可方便地用于傳染病病原的間接免疫熒光檢測，省去了直接免疫熒光檢測時(shí)需要針對每種病原的抗體制備熒光標(biāo)記抗體的麻煩，同時(shí)采用標(biāo)記的抗抗體作為信號放大系統(tǒng)，還能提高免疫熒光檢測的靈敏度。目前國內(nèi)外尚沒有RPC應(yīng)用到動(dòng)物疫病檢測中的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及一種R-藻藍(lán)蛋白(RPC)標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法。

本發(fā)明采用的R-藻藍(lán)蛋白(RPC)是純化自多管藻的典型的二峰型藻藍(lán)蛋白，是唯一同時(shí)含有PEB和PCB的藻膽蛋白，具有無毒性、水溶性大、熒光明亮且不易淬滅等特點(diǎn)。RPC的組成和晶體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了低穩(wěn)定性，因此在蛋白質(zhì)交聯(lián)是控制交聯(lián)劑的濃度是關(guān)鍵，濃度過高會(huì)造成RPC的變性和熒光喪失，濃度過低則交聯(lián)效率降低。

本發(fā)明的解決方案如下：

RPC的制備：RPC的制備由多管藻中采用陰離子交換層析法分離純化，純化過程為：取冷凍保存的多管藻，加入20mM醋酸緩沖液(pH5.8)，4℃下溶脹24h，多層紗布過濾、擠壓獲得褐色浸提液，然后加入固體硫酸銨至濃度為60％(w/v)，4℃放置24h，離心收集沉淀，將沉淀溶于20mM的醋酸緩沖液(pH5.8)中，然后對20mM的醋酸緩沖液(pH5.8)透析，透析液加到用20mM醋酸緩沖液(pH5.8)(含50mM?NaCl)預(yù)平衡過的陰離子交換柱，用20mM醋酸緩沖液(pH5.8)沖洗掉陰離子交換柱上過量的R-藻藍(lán)蛋白，用20mM醋酸緩沖液(pH4.8)(含50mMNaCl)一步洗脫就可得到大量純的R-藻藍(lán)蛋白，純化的多管藻RPC純度達(dá)電泳純，純度指數(shù)A₆₂₀/A₂₈₀＞4.5，結(jié)構(gòu)式為(αβ)₃，分子量約為110kDa，最大吸收峰分別位于540、620nm，室溫?zé)晒獍l(fā)射峰位于640nm，純化的RPC硫酸銨沉淀4℃避光保存，使用前用50mM?pH7.5PBS充分透析除鹽，調(diào)整濃度為10mg/mL。

RPC標(biāo)記熒光抗抗體的制備：抗抗體為抗雞IgG抗體、抗豬IgG抗體，購自Sigma公司，標(biāo)記時(shí)用PBS透析，調(diào)整蛋白濃度為5mg/ml。RPC與抗抗體的交聯(lián)采用蛋白質(zhì)交聯(lián)法。利用異型雙功能交聯(lián)劑SPDP分別在RPC、抗抗體上衍生吡啶二硫基團(tuán)，然后用DTT還原抗抗體的衍生物引入游離-SH，將攜帶吡啶二硫基的RPC與攜帶巰基的抗抗體按一定摩爾比交聯(lián)制備熒光抗抗體。以DMSO準(zhǔn)確配制SPDP母液，SPDP與RPC、抗抗體的摩爾比分別為20-30∶1、50-100∶1，混勻、鋁箔封好后于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2h，超濾離心除去多余的SPDP。取DTT按50-100∶1的摩爾比與抗抗體衍生物充分混勻，室溫靜置反應(yīng)1h，超濾離心除去多余的DTT，抗抗體-HS與RPC衍生物以摩爾比1∶2-3混勻，鋁箔封好后于20-25℃振蕩反應(yīng)20h。加NEM封閉多余巰基，室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60min。