[發(fā)明專利]一種R-藻藍(lán)蛋白標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010284339.0
• 申請日: 2010-09-17
• 公開（公告）號: CN101980020A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱麗萍;顏世敢;顏士勇
• 申請（專利權(quán)）人: 顏世敢
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;C07K14/405;C07K1/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種R-藻藍(lán)蛋白(RPC)標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法，包括：陰離子交換層析法制備多管藻RPC，分別用摩爾比20-30∶1、50-100∶1的交聯(lián)劑SPDP將RPC、抗抗體衍生，抗抗體的SPDP衍生物經(jīng)摩爾比50-100∶1的DTT還原獲得帶-HS的抗抗體，帶-HS的抗抗體與RPC的衍生物以摩爾比1∶2-3液相交聯(lián)，經(jīng)HPLC純化制備出熒光抗抗體，制備的熒光抗抗體得率高、純度高、穩(wěn)定性好、熒光呈明亮的紅色，可作為通用熒光探針用于雞、豬傳染病的間接免疫熒光檢測。

2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中RPC的制備由多管藻中采用陰離子交換層析法分離純化，純化步驟為：取冷凍保存的多管藻，加入20mM醋酸緩沖液(pH5.8)，4℃下溶脹24h，多層紗布過濾、擠壓獲得褐色浸提液，然后加入固體硫酸銨至濃度為60％(w/v)，4℃放置24h，離心收集沉淀，將沉淀溶于20mM的醋酸緩沖液(pH5.8)中，然后對20mM的醋酸緩沖液(pH5.8)透析，透析液加到用20mM醋酸緩沖液(pH5.8)(含50mM?NaCl)預(yù)平衡過的陰離子交換柱，用20mM醋酸緩沖液(pH5.8)沖洗掉陰離子交換柱上過量的樣品和雜質(zhì)，用20mM醋酸緩沖液(pH4.8)(含50mM?NaCl)一步洗脫就可得到大量純的RPC，純化的多管藻RPC純度達(dá)電泳純，純度指數(shù)A₆₂₀/A₂₈₀＞4.5，結(jié)構(gòu)式為(αβ)₃，分子量約為110kDa，最大吸收峰分別位于540、620nm，室溫?zé)晒獍l(fā)射峰位于640nm，純化的RPC硫酸銨沉淀4℃避光保存，使用前用50mM?pH7.5PBS充分透析除鹽，調(diào)整濃度為5mg/mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中抗抗體為抗雞IgG抗體、抗豬IgG抗體，購自Sigma公司，電泳檢測純度達(dá)電泳純，對流免疫電泳法檢測抗抗體具有良好的生物學(xué)活性，標(biāo)記時用PBS透析，調(diào)整蛋白濃度為5mg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中熒光抗抗體的制備采用蛋白質(zhì)交聯(lián)技術(shù)在液相體系中化學(xué)交聯(lián)制備，制備方法為：以DMSO準(zhǔn)確配制SPDP母液，分別用雙功能化學(xué)交聯(lián)劑SPDP衍生RPC、抗抗體，SPDP與RPC、抗抗體的摩爾比分別為20-30∶1、30-60∶1，混勻、鋁箔封好后于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2h，超濾離心除去多余的SPDP。取DTT按30-60∶1的摩爾比與抗抗體衍生物充分混勻，室溫靜置反應(yīng)1h，超濾離心除去多余的DTT，抗抗體-HS與RPC衍生物以摩爾比1∶2-3混勻，鋁箔封好后于20-25℃振蕩反應(yīng)20h，加NEM封閉多余巰基，室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中熒光抗抗體經(jīng)HPLC純化，純化在液相色譜工作站上進(jìn)行，液相柱型號TSK?G3000sw(規(guī)格7.5mm×60cm)，流動相為50mM?pH?7.5PBS，流速0.5ml/min，檢測波長190-800nm，收集洗脫19.57min出現(xiàn)的產(chǎn)物峰，置4℃避光保存。