[發明專利]乳腺癌分子標志物相關探針的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201010284090.3
• 申請日: 2010-09-15
• 公開（公告）號: CN102399772A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 李明;何瑰;陳華云
• 申請（專利權）人: 中山大學達安基因股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種HER2、TOP2A、AGTR1基因探針的制備方法，其特征在于3種基因探針的制備步驟包括：

(1)克隆篩選：通過NCBI?Mapview數據庫檢索所有含有HER2基因、TOP2A基因、AGTR1基因的克隆，并對這些克隆進行篩選，選擇最優的克隆。

(2)克隆培養和鑒定：按照篩選確定的克隆編號購買克隆Invitrogen?RPCI11.C，取10μl克隆菌液添加到5ml含氯霉素抗性的TB培養液中，37℃搖床中搖菌活化培養8～12小時；再將菌液全部加入至500ml含氯霉素抗性的TB培養液中，37℃搖床中搖菌培養8～12小時；針對HER2、TOP2A、AGTR1基因探針使用相應的STS引物進行PCR擴增，并通過2％瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物片段進行分析，從而完成待選克隆的鑒定。

(3)基因探針制備：對鑒定陽性的菌液，進行質粒DNA的提取；通過OD值的測定對質粒DNA進行定量；然后，通過缺口平移方法對質粒DNA進行熒光標記；對標記產物進行乙醇沉淀和濃縮；獲得探針，避光、-20±5℃儲存。

(4)基因探針驗證：使用人類正常分裂中期淋巴細胞滴片進行探針驗證。

2.根據權利要求1的方法，其特征還在于克隆篩選步驟中含有HER2基因最優的克隆，編號為RP11-909L6，含有TOP2A基因最優選的克隆，編號為RP11-1029L16，含有AGTR1基因最優選的克隆，編號為RP11-366P9。

3.根據權利要求1的方法，其特征還在于克隆培養和鑒定步驟中使用的STS引物對序列分別為：

HER2基因探針：上游引物5’-AGGGGAGAATAAATAAAATCTGTGG-3’和下游引物5’-CAGGAGTGAGACACTCTCCATG-3’；

TOP2A基因探針：上游引物5’-ATTCAAAGCTGGATCCCTTT-3’和下游引物5’-AGCTGTGACAAATGCCTGTA-3’；

AGTR1基因探針：上游引物5’-TTGCATTATTTTCAAAGCCCTT-3’和下游引物5’-TCCTACCAGCTTAGGCCAGA-3’。

4.根據權利要求1的方法，其特征還在于基因探針制備過程中50μl切口平移體系中DNA聚合酶I的使用量在10U～20U間，DNase?I使用量在0.001U～0.01U間。

5.一種乳腺癌熒光原位雜交檢測試劑盒，包括：1)雜交緩沖液、熒光標記探針混合物、未標記的競爭性DNA、DAPI復染劑，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，熒光標記探針混合物包含17號染色體計數探針以及按權利要求1的方法制備的HER2基因探針、TOP2A基因探針、AGTR1基因探針，其特征在于每人份熒光標記探針混合物中HER2基因探針、TOP2A基因探針、AGTR1基因探針的使用量均為0.5μl，17號染色體計數探針的使用量為5～10ng。

6.根據權利要求5的試劑盒，其特征還在于未標記的競爭性DNA為Human?COT-1?DNA。