[發明專利]一種粘桿菌素高產菌株及其篩選方法

無效

• 申請號: 201010284048.1
• 申請日: 2010-09-17
• 公開（公告）號: CN101974452A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 李琪;李建梅;袁昉;王培培;李敏
• 申請（專利權）人: 河北圣雪大成制藥有限責任公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/07
• 代理公司: 石家莊國域專利商標事務所有限公司 13112
• 代理人: 白海靜

技術領域

本發明涉及多粘芽孢桿菌及其篩選方法，具體地說是一種粘桿菌素高產菌株及其篩選方法。

背景技術

粘桿菌素(Colistin)又稱粘菌素、抗敵素、克利斯汀，是1947年由美國和英國的學者在多粘芽孢桿菌(Bacillus?polymyxa)培養液中與多粘菌素B(PolymyxinB)一起發現的，當時被稱為多粘菌素E(Polymyxin?E)。后來由粘桿菌素芽孢桿菌(Bacillus?colistinus)發酵生產，改稱為粘桿菌素。它是一種帶有氨基酸和脂肪酸側鏈的堿性環肽類抗生素，能與細菌細胞質膜上的脂類結合而擾亂細胞膜的功能，并破壞細胞壁的完整性，對革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌、流感桿菌、百日咳桿菌、產氣桿菌、變形桿菌特別是綠膿桿菌有很強的殺菌作用，且不易產生抗藥性，臨床上主要用于治療由上述敏感菌引起的胃腸道感染、手術后感染、燒傷后感染和其他局部感染，也用作飼料添加劑。

目前，粘桿菌素產生菌的選育主要采用誘變育種與隨機篩選相結合的方法，但是，這種方法效率偏低，發酵單位提高較慢。邢維玲，周希貴等公開了一種“多粘菌素E高產菌株的選育方法(中國抗生素雜志2002，27(6)：326-327)，該方法是采用誘變和理性化相結合的一種篩選方法。它以多粘芽孢桿菌18-3為出發株，采用紫外誘變，并以重金屬Cu2+作為篩選因子，獲得一株遺傳穩定且多粘菌素E發酵效價比出發菌株提高45％的菌株，對該菌株再采用亞硝基胍(NTG)誘變，以結氨酸結構類似物α-氨基丁酸作為篩選因子時得到一株產量提高34％的菌株，最終發酵單位為16295U/ml。該方法雖然提高了菌株的生產效率，但其篩選方法依舊繁瑣、復雜，且菌株的發酵單位仍有待進一步提高。

發明內容

本發明的目的就是要提供一種粘桿菌素高產菌株，同時提供一種簡捷、易操作的篩選該菌株的方法。

本發明的目的是這樣實現的：

本發明所提供的粘桿菌素高產菌株，其菌株保藏名稱為DCLL488，保藏單位CGMCC，保藏編號為CGMCC?NO：4099，保藏日期2010年08月24日。

本發明所提供的粘桿菌素高產菌株的篩選方法，依次包括以下步驟：

a、將粘桿菌素芽孢桿菌接種于活化培養液中，在溫度28℃-37℃，搖床轉速為200rpm，活化培養20h-36h，制成成熟活化菌液；活化培養液的組成為：以質量百分配比計，葡萄糖1％-5％、酵母粉1％-5％、氯化鈉0.3％-1.0％，水余量；pH6.5-7.0

b、取成熟活化菌液，加入體積質量比濃度為0.5mg/ml、水溫為40℃-55℃的乙硫氨酸或甲硫氨酸水溶液，進行稀釋；

c、選擇稀釋度為10^-2-10^-6的稀釋液，依次涂布于固體培養基平板上，在溫度為28℃-37℃，濕度為40％-60％條件下，培養48h-100h；固體培養基的組成為：以質量百分配比計，葡萄糖1％-3％、酵母膏1％-3％、蛋白胨0.1％-0.5％、氯化鈉0.1％-0.5％、瓊脂2.2％，水余量，pH6.0-7.0；

d、挑取c步所培養的單個菌落，劃線涂布于斜面培養基，再按照c步所述條件進行培養；

e、菌種培養：將斜面上的菌苔刮下接種于種子培養基中，在溫度28℃-37℃，搖床轉速為200rpm，條件下培養20h-30h；種子培養基的質量百分配比為葡萄糖1％-3％、酵母粉4％-6％、氯化鈉0.1％-0.5％、磷酸二氫鉀0.05-0.1％，水余量，pH6.0-7.0；

f、發酵培養：將菌種接種發到發酵培養基中，在溫度28℃-37℃，搖床轉速為200rpm條件下，搖瓶培養48h-96h；發酵培養基的質量百分配比為豆粕粉3％-5％、硫酸銨1％-3％、磷酸二氫鉀0.05-0.1％、七水硫酸亞鐵0.01％-0.07％，水余量，pH6.0-7.0；發酵采用八層紗布。

在上述b步工序中，所說的水溫優選40℃-45℃和50℃-55℃。由此可進一步高產菌株的篩選效率，同時也能進一步提高高效菌株的發酵單位。

布于e步工序中，最好將斜面培養基上培養好的菌種加入20％甘油保藏管(mg/ml)中，先在4℃冰箱內凍存，再-70℃液氮冷凍保藏，以進一步提高其存活率。然后再將其進行發酵培養。

本發明采用對粘桿菌素產生菌進行代謝調控和溫度梯度篩選相結合的方法，實現了粘桿菌素高產菌株的篩選，提高了粘桿菌素菌的生產效率。本發明篩選工藝簡單、易操作。因而可有效降低生產成本，同時也有利于進行大規模的篩選。