[發(fā)明專利]制備基因工程菌株的方法及生產(chǎn)藤黃綠菌素的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010282431.3
• 申請日: 2010-09-15
• 公開（公告）號: CN101948790A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許煜泉;黃顯清
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/03;C12P17/10;C12R1/38
• 代理公司: 上海交達專利事務(wù)所 31201
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的菌株及利用該菌株生產(chǎn)抗生素的方法，具體是一種制備基因工程菌株的方法及生產(chǎn)藤黃綠菌素的方法。

背景技術(shù)

假單胞菌(Pseudomonas?sp.)M18是從上海郊區(qū)甜瓜根際分離篩選到的一株重要的植物根際促生假單胞菌株，它能分泌一種聚酮類抗生素-藤黃綠菌素(Huang?XQ，etal.Identification?and?characterization?of?pltZ，a?gene?involved?in?therepression?of?pyoluteorin?biosynthesis?in?Pseudomonas?sp.M18.FemsMicrobiology?Letters?2004，232：197～202)。藤黃綠菌素由一個間苯二酚環(huán)(起源于聚酮生物合成)和一個氯化的吡咯環(huán)的部分結(jié)構(gòu)共同組成，具有廣譜活性，能抑制細菌和真菌，特別是抑制卵菌屬真菌如終極腐霉等，可用于除草(Haas?D，Defago?G，Biological?control?of?soi?l-borne?pathogens?by?fluorescent?pseudomonads.NatureReviews?Microbiology?2005，3：307～319)。離體培養(yǎng)皿生物測定顯示，藤黃綠菌素對各種農(nóng)作物真菌性病原菌特別是對水稻紋枯病菌、腐霉和疫霉等具有高效的廣譜抑菌作用。藤黃綠菌素在自然界中易降解、無殘留，是一種高效、安全、低毒、低殘留、環(huán)保型的微生物源農(nóng)藥。假單胞菌(Pseudomonas?sp.)M18野生型分泌的藤黃綠菌素濃度非常低，不適合規(guī)模化的工業(yè)生產(chǎn)。為了進一步提高藤黃綠菌素產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本，實現(xiàn)藤黃綠菌素的產(chǎn)業(yè)化，迫切需要大幅度提高藤黃綠菌素的發(fā)酵效價。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種制備基因工程菌株的方法及生產(chǎn)藤黃綠菌素的方法。利用本發(fā)明制備的pqsR基因阻斷工程菌M18PRG，每升發(fā)酵液中，藤黃綠菌素的發(fā)酵效價約為150毫克，與現(xiàn)有技術(shù)相比發(fā)酵效價提高了3～4倍，該工程菌可為進一步構(gòu)建多基因高產(chǎn)工程菌株應(yīng)用于微生物源農(nóng)藥生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的，

第一方面，本發(fā)明涉及一種基因工程菌株的制備方法，包括如下步驟：

步驟一，從假單胞菌(Pseudomonas?sp.)M18的總基因組DNA中克隆pqsR基因；

步驟二，將pqsR基因亞克隆至攜帶抗生素抗性基因的質(zhì)粒，得重組質(zhì)粒；

步驟三，在pqsR基因中插入抗生素抗性基因，構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒；

步驟四，將重組自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，之后與假單胞菌(Pseudomonas?sp.)M18野生型菌株雙親雜交；

步驟五，利用含有步驟三所述抗生素的培養(yǎng)基和含有步驟二所述抗生素的培養(yǎng)基進行篩選，得到能在含步驟三所述抗生素的培養(yǎng)基上生長，且在含步驟二所述抗生素的培養(yǎng)基上不能生長的菌株，即得基因工程菌株。

步驟二中，所述質(zhì)粒為pEX18Tc、pEX18Gm或pEX18Ap。

優(yōu)選地，所述質(zhì)粒為pEX18Tc。

步驟二中，所述抗生素抗性基因為四環(huán)素抗性基因、慶大霉素抗性基因或氨芐青霉素抗性基因。

優(yōu)選地，所述抗生素抗性基因為慶大霉素抗性基因。

步驟三中，所述抗生素抗性基因為慶大霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因。

步驟四中，所述大腸桿菌為大腸桿菌SM10。

步驟五中，所述培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。

第二方面，本發(fā)明還涉及利用前述基因工程菌株生產(chǎn)藤黃綠菌素的方法，包括如下步驟：

步驟一，培養(yǎng)基因工程菌株，得發(fā)酵液；

步驟二，提純發(fā)酵液，得藤黃綠菌素。

步驟一中，所述培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基具體為：該培養(yǎng)基的pH為7.5，1L培養(yǎng)基的組分為：蛋白胨20g，甘油15mL，MgSO₄?1.5g，K₂HPO₄0.3g，余量為水。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：本發(fā)明克隆了假單胞菌(Pseudomonas?sp.)M18中強烈抑制藤黃綠菌素生物合成的負調(diào)控基因pqsR、阻斷了pqsR基因的功能，構(gòu)建了基因工程菌M18PRG，利用本發(fā)明制備的pqsR基因阻斷工程菌M18PRG，每升發(fā)酵液中，藤黃綠菌素的發(fā)酵效價約為150毫克，與現(xiàn)有技術(shù)相比發(fā)酵效價提高了3～4倍，該工程菌可為進一步構(gòu)建多基因高產(chǎn)工程菌株應(yīng)用于微生物源農(nóng)藥生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。