[發明專利]融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經氨酸的方法

無效

• 申請號: 201010282400.8
• 申請日: 2010-09-10
• 公開（公告）號: CN101979644A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發明（設計）人: 梅松
• 申請（專利權）人: 揚州博生源生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/81;C12N9/00;C12N9/88;C12N9/90
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 許必元

技術領域

本發明公開了一種融合酶蛋白一步催化制備N-乙酰神經氨酸的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

N-乙酰神經氨酸是一個含9個碳原子并具有吡喃糖結構的酸性氨基糖，廣泛存在于許多生物體內，隨著生物進化程度的增加，唾液酸及衍生物在生物體內的含量亦增加。在動物體內和多種微生物表面，因唾液酸帶有一個羧基而賦予細胞和許多復合糖的負電荷性質。在細胞與細胞之間、細胞與外界環境之間的信號傳遞和識別過程中，唾液酸殘基起著至關重要的作用。經過近十幾年的發展，糖生物學和糖化學在生物工程和制藥工業中的作用日顯重要。在以糖為基礎的治療藥物中，流感病毒唾液酸酶抑制劑的開發是一個成功的例子。如上所述，由于唾液酸酶對于新生成病毒從細胞表面的唾液酸受體釋放是必需的，因此抑制唾液酸酶可終止病毒的復制，呈現該病的嚴重性減弱和病程縮短。如葛蘭素公司推出的抗病毒新藥Zanamivir就是N-乙酰神經氨酸的類似物。

唾液酸是一種必需的和豐富的定位于細胞表面聚糖末端的氨基糖。它在很多生物學中有重要作用，比如病毒侵染，病毒的神經氨酸酶移走受感染細胞表面的唾液酸是其形成病毒顆粒后進行釋放的基本步驟。因此唾液酸類似物被廣泛的應用于抗病毒藥物。如葛蘭素公司推出的抗病毒新藥Zanamivir就是N-乙酰神經氨酸的類似物，可以阻抑A和B型流感病毒的神經氨酸酶，它已經被商業化生產，用于避免高致病H5N1病毒的感染。

由于唾液酸存在于人乳中，并且大量研究已經證實唾液酸對于增強嬰兒的免疫力和提高大腦的發育有重要作用，唾液酸可以添加到一些嬰幼兒奶粉中。因此唾液酸的規模化生產對于醫藥及食品工業有重要的作用。

唾液酸的酶法合成主要是以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸鈉為底物，在N乙酰神經氨酸醛縮酶的作用下生成N-乙酰神經氨酸。但是由于N-乙酰甘露糖胺的價格昂貴，所以實際上有“化學加酶法”和“雙酶法”兩種方法。“化學加酶法”是將廉價的N乙酰葡萄糖胺在堿性條件下進行異構化生成N-乙酰甘露糖胺，但是此方法回收率較低，環境污染嚴重，限制了其大規模應用。“雙酶法”是采用N乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶制備成N-乙酰甘露糖胺，但是該酶提取困難，重組表達的酶活比較低，并且兩個酶催化兩步反應工藝復雜，不能滿足大規模生產的需求。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，公開了一種融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經氨酸的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的，融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經氨酸的方法，其特征是包括以下步驟：

(1)利用重疊PCR技術，將N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶和N-乙酰神經氨酸醛縮酶的基因連在一起，導入畢赤酵母宿主細胞中，從而獲得具有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶和N-乙酰神經氨酸異構酶活性的融合蛋白；

(2)反應體系的pH為6.5-8.0，反應溫度為30-40℃，N-乙酰葡萄糖胺與丙酮酸及其鹽的重量比為1-1.2，將N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸及其鹽與游離的融合酶蛋白或者固定化的融合蛋白混勻，反應得到混合物；

(3)從反應混合物分離制備N-乙酰神經氨酸。

所述的步驟(1)中的融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶為E.C.5.1.3.8；融合蛋白中N-乙酰神經氨酸醛縮酶為E.C.4.1.3.3。

所述的融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶包括具有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶活性的多肽，N-乙酰神經氨酸醛縮酶包括具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的多肽；

所述的融合蛋白的融合方式：(1)第一區位于融合蛋白的N端，第二區位于融合蛋白的C端；(2)第一區位于融合蛋白的C端，第二區位于融合蛋白的N端；

優選的融合方式為N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶N端與N-乙酰神經氨酸異構酶C端融合。

所述的步驟(1)中的融合蛋白還包括在N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶和N-乙酰神經氨酸異構酶之間加入0-30個長度的氨基酸作為連接肽。

所述的步驟(1)中的融合蛋白還包括在N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶和N-乙酰神經氨酸異構酶之間加入10個氨基酸長度或(G₄S)₅作為連接肽，優選(G₄S)₅作為連接肽。

所述的反應體系的pH為6.5-8.0，反應溫度為30-40，N-乙酰葡萄糖胺與丙酮酸及其鹽的重量比為1-1.8，其中優選pH?7.5，溫度36℃，N-乙酰葡萄糖胺與丙酮酸及其鹽的重量比為1.5倍。