[發明專利]融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經氨酸的方法

無效

• 申請號: 201010282400.8
• 申請日: 2010-09-10
• 公開（公告）號: CN101979644A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發明（設計）人: 梅松
• 申請（專利權）人: 揚州博生源生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/81;C12N9/00;C12N9/88;C12N9/90
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 許必元

1.融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經氨酸的方法，其特征是包括以下步驟：

(1)利用重疊PCR技術，將N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶和N-乙酰神經氨酸醛縮酶的基因連在一起，導入畢赤酵母宿主細胞中，從而獲得具有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶和N-乙酰神經氨酸異構酶活性的融合蛋白；

(2)催化反應體系的pH為6.5-8.0，反應溫度為30-40℃，N-乙酰葡萄糖胺與丙酮酸及其鹽的重量比為1-1.8，將N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸及其鹽與游離的融合酶蛋白或者固定化的融合蛋白混勻，反應得到混合物；

(3)從反應混合物分離制備N-乙酰神經氨酸。

2.根據權利要求1所述的融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經氨酸的方法，其特征是所述的步驟(1)中的融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶為E.C.5.1.3.8，N-乙酰神經氨酸醛縮酶為E.C.4.1.3.3。

3.根據權利要求1所述的融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經氨酸的方法，其特征是所述的步驟(1)中融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶包括具有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶活性的多肽，N-乙酰神經氨酸醛縮酶包括具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的多肽。

4.根據權利要求1所述的融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經氨酸的方法，其特征是所述的融合蛋白的融合方式為：(1)第一區位于融合蛋白的N端，第二區位于融合蛋白的C端；(2)第一區位于融合蛋白的C端，第二區位于融合蛋白的N端。

5.根據權利要求1所述的融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經氨酸的方法，其特征是所述的步驟(1)中的融合蛋白包括在N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶和N-乙酰神經氨酸異構酶之間加入0-30個長度的氨基酸作為連接肽。

6.根據權利要求1所述的融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經氨酸的方法，其特征是所述的融合蛋白的宿主細胞是細菌或酵母或動物細胞或植物細胞。

7.根據權利要求1所述的融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經氨酸的方法，其特征是所述的步驟(1)中的融合蛋白在宿主細胞內表達或從宿主細胞中分泌出來。

8.根據權利要求1所述的融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經氨酸的方法，其特征是所述的步驟(1)中的融合蛋白包括固定后的酶蛋白。

9.根據權利要求1所述的融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經氨酸的方法，其特征是所述的步驟(2)中固定化的融合蛋白所用的載體為高分子合成材料或木炭或陶瓷或玻璃或纖維素。