[發明專利]應用生物反應器工業化生產豬瘟活疫苗的方法

有效

• 申請號: 201010282143.8
• 申請日: 2010-09-15
• 公開（公告）號: CN102038944A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發明（設計）人: 漆世華;劉漢平;秦紅剛;肖敏;溫文生;段振華;肖敏;王威;張萍
• 申請（專利權）人: 武漢中博生物股份有限公司
• 主分類號: A61K39/187
• 分類號: A61K39/187;C12N7/00;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 唐正玉

技術領域

本發明涉及到獸用生物制品技術領域，具體涉及到一種應用生物反應器工業化生產豬瘟活疫苗的方法。

背景技術

豬瘟是由豬瘟病毒(classical?swine?fever?virus，CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，它對全世界的養豬業構成巨大威脅。不同年齡、性別和品種的豬均能感染，死亡率高達80～90％。在我國，豬瘟流行呈現典型豬瘟和非典型豬瘟共存、持續感染與隱性感染共存、免疫耐受和帶毒綜合癥共存等現象。豬瘟新的流行形式給我國養豬業提出了新的挑戰，免疫接種仍是防制豬瘟的重要措施。

當前豬瘟活疫苗的生產主要采用傳統的轉瓶培養工藝。雖然該工藝已經使用數十年，且已成熟穩定，但轉瓶培養技術至今仍存在培養細胞密度低、細胞碎片與雜蛋白多、培養病毒滴度低、產品質量不均一、不穩定以及生產效率低、成本高等缺陷，這與當前豬瘟活疫苗的大規模生產需要越來越不相適應。

專利公開號為CN?101492657A的專利申請，公開了豬瘟活疫苗ST細胞培養方法，生產工藝為轉瓶培養。專利公開號為CN?101181637A的專利申請，公開了用細胞系生產豬瘟活疫苗的方法，其細胞系為ST、PK-15和IBRS-2細胞系，生產工藝為細胞培養瓶單層培養。專利公開號為CN101695571?A的專利申請，公開了一種利用生物反應器生產豬瘟活疫苗的方法及制品，其生物反應器為TideCell固定床微載體生物反應器。但是利用攪拌式生物反應器，采用逐級放大的倒罐式操作技術，進行細胞的高密度培養以制備疫苗，未見報道。

發明內容

本發明的目的為了克服豬瘟活疫苗現有生產工藝的缺陷，提供了一種應用生物反應器工業化生產豬瘟活疫苗的方法，其優點是設備占地面積小、生產規模大；培養速度快、生產效率高；生產機械化，易于自動控制；培養設備密閉，不易污染；副產物少，疫苗的副反應小；生產的病毒液效價高，與傳統的轉瓶工藝相比，收獲的病毒液滴度增加了5～10倍，疫苗質量穩定。

本發明的技術方案為：

應用生物反應器工業化生產豬瘟活疫苗的方法，其特征在于包括如下步驟：(1)將微載體和生物反應器經滅菌后，加入細胞生長液，接種制苗用細胞進行培養，待微載體上的細胞形成致密的單層，棄去細胞生長液，加入病毒維持液并接種豬瘟病毒，繼續培養使病毒繁殖；(2)接毒后18h，連續收獲病毒培養液，合并病毒培養液加凍干保護劑制備豬瘟活疫苗。

病毒的接種量為培養體積的1～2％。

所述的生物反應器設定參數為：pH?6.5～7.8、溫度33～37℃、溶氧30～80％、攪拌速度30～100rpm。考慮到細胞培養的最適條件，優選的pH7.0～7.4、細胞培養階段溫度設定37℃，病毒培養階段溫度設定35℃、溶氧50％、攪拌速度30～100rpm。

所述的微載體為Cytodex系列微載體，微載體的使用密度為2～25g/L。

所述的制苗用細胞為SK6細胞、ST細胞或PK-15細胞。

所述的細胞生長液為含體積濃度為8～10％小牛血清的DMEM或DMEM/F12，病毒維持液為含體積濃度為1～2％小牛血清的DMEM或DMEM/F12。

所述的生物反應器容積為14～150L，或，制苗用細胞經過14L～40L或14L～40L～150L逐級放大培養后，即通過胰酶將14L生物反應器培養的細胞消化下來，作為種子細胞接種到40L的生物反應器，再將40L生物反應器內培養的細胞消化下來作為種子細胞接種到150L生物反應器，如此形成生物反應器之間的逐級放大培養，從而避免了單純的用轉瓶培養種子細胞而容易造成污染和增加勞動強度的缺陷，于40L或150L生物反應器培養豬瘟病毒；或直接用14L、40L的生物反應器培養病毒。

所述生物反應器的培養采用批式、流加或灌注培養的方式，灌注的速率根據細胞的密度為每天0.5～5個工作體積。細胞接種病毒后，可以采用灌注的方式不斷收獲培養上清病毒液。

所述的生物反應器為攪拌式生物反應器。

本發明采用生物反應器微載體培養技術進行細胞的高密度培養，生產豬瘟活疫苗，與傳統的轉瓶生產工藝相比，自動化控制程度高，生產可實時監控；節省人力，降低成本；生產用地少，規模易于擴大；生產的病毒滴度高，批間差異小，產品質量穩定，副反應小。

附圖說明

圖1為本發明實施例1的工藝流程圖。

圖2為細胞生長曲線。

具體實施方式

以下是本發明一個具體的實施方案，以進一步的闡述本發明，但不能解釋為限制本發明的范圍。

實施例1