[發(fā)明專利]慶大霉素液相芯片探針的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010281374.7
• 申請(qǐng)日: 2010-09-15
• 公開（公告）號(hào): CN101982773A
• 公開（公告）日: 2011-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭池方;陳偉;匡華;劉麗強(qiáng);胥傳來
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/533
• 分類號(hào): G01N33/533
• 代理公司: 北京華夏博通專利事務(wù)所 11264
• 代理人: 孫東風(fēng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的一種慶大霉素檢測(cè)試劑的制備方法，尤其涉及一種慶大霉素液相芯片探針的制備方法。

背景技術(shù)

慶大霉素(Gentamicin)屬氨基糖苷類抗生素藥物，對(duì)革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、沙門氏菌、肺炎球菌、變形桿菌屬、腸桿菌屬、巴斯德氏菌、志賀菌屬等具有高度的抗菌活性，在人類及家畜臨床中應(yīng)用廣泛。慶大霉素的毒副作用為具有一定的腎毒性和肝毒性。動(dòng)物治療中，由于不規(guī)范用藥等原因，導(dǎo)致在動(dòng)物組織及食品中殘留慶大霉素，從而會(huì)帶來一定的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，許多國家都對(duì)慶大霉素在動(dòng)物組織或動(dòng)物源食品中規(guī)定了最大殘留限量。

對(duì)于動(dòng)物食品中慶大霉素的殘留，國內(nèi)外多以色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法為主，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)靈敏度高，但是對(duì)實(shí)驗(yàn)室儀器和人員要求高，檢測(cè)方法復(fù)雜，檢測(cè)通量較低，成本較高，實(shí)際中難以滿足大量樣本的檢測(cè)需求。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)成本較低，但是一般檢測(cè)藥物種類單一，檢測(cè)線性范圍窄。

液相芯片技術(shù)是美國Luminex公司開發(fā)的一種多功能的分析平臺(tái)。它將流式檢測(cè)與芯片技術(shù)有機(jī)地結(jié)合在一起，在保持高通量檢測(cè)的同時(shí)，將反應(yīng)體系由液相-固相反應(yīng)改變?yōu)橐合喾磻?yīng)體系，對(duì)于確保高級(jí)結(jié)構(gòu)之上的蛋白質(zhì)相互作用尤為關(guān)鍵。液相芯片技術(shù)的載體是聚苯乙烯所制作的微珠，包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑，可產(chǎn)生100種不同比例顏色的微珠，每一種用于標(biāo)記探針的微珠都帶有一個(gè)獨(dú)特的色彩編號(hào)。每一種微球采用不同探針標(biāo)記，并將標(biāo)記探針的微珠與待測(cè)物在液相中反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物通過液相芯片的檢測(cè)通道，每次僅允許一個(gè)微球通過檢測(cè)通信道，通過兩種激光檢激發(fā)測(cè)，紅色激光可定位微球的編碼地址，綠色激光則激發(fā)待測(cè)樣本的報(bào)告分子(R-澡紅蛋白)實(shí)現(xiàn)樣本目標(biāo)物的定量分析。液相芯片的檢測(cè)模式可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目標(biāo)物的多樣性，對(duì)樣品利用率高，檢測(cè)速度快，可根據(jù)實(shí)際檢測(cè)對(duì)象的需要對(duì)不同種類的探針進(jìn)行組合，靈活性大。

近年來，在液相芯片系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了對(duì)小分子藥物的檢測(cè)。小分子藥物液相芯片探針的制備工藝常見的方法為：首先制備小分子半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，然后將這種偶聯(lián)物與羧基化的熒光微球反應(yīng)，從而得到該小分子的液相芯片探針。這種工藝采用載體蛋白為連接臂，由于載體蛋白與小分子偶聯(lián)反應(yīng)以及偶聯(lián)物與微球的反應(yīng)重復(fù)性較差，限制了其實(shí)際中的應(yīng)用推廣。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提出一種慶大霉素液相芯片探針的制備方法，其采用在液相芯片用的熒光微球表面標(biāo)記慶大霉素分子的方式，構(gòu)建出一種可特異性識(shí)別慶大霉素抗體的新型免疫分析固相界面，其可進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用于慶大霉素的液相芯片模式檢測(cè)，從而克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

一種慶大霉素液相芯片探針的制備方法，其特征在于，該方法為：

(1)取羧基化聚苯乙烯熒光微球均勻分散于pH值為6.0～7.0，含0.05M～0.2M的磷酸鹽緩沖溶液中，經(jīng)超聲處理后，再加入過量新鮮配置的50mg/ml氮羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽和50mg/ml水溶性碳二亞胺水溶液，均勻混合后，室溫下暗處震蕩孵育15～30min，而后離心移去上清，加入過量0.01％～0.1％的甘氨酸、3-氨基丙酸或4-氨基丁酸溶液，均勻混合后，室溫下暗處孵育15～30min后，離心移去上清，以pH值為7.2～8.0、濃度為0.05M～0.2M的磷酸鹽緩沖溶液洗滌沉淀物，制得初次活化后的熒光微球；

(2)將上述初次活化后的熒光微球加入過量新鮮配制的含50mg/ml氮羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽和50mg/ml水溶性碳二亞胺的水溶液中，均勻混合后，室溫下暗處震蕩孵育15～30min，完成對(duì)熒光微球的再次活化，其后加入過量的含0.01～1μg/mL慶大霉素的磷酸鹽緩沖溶液，室溫下暗處震蕩孵育1～2h，離心移去上清，以pH值為7.2～8.0、濃度為0.05M～0.2M的磷酸鹽緩沖溶液洗滌沉淀物，制得目標(biāo)產(chǎn)物慶大霉素液相芯片探針。

進(jìn)一步地講：步驟(1)中，所述羧基化聚苯乙烯熒光微球是經(jīng)水洗處理后，再被分散于pH值為6.0～7.0、濃度為0.05M～0.2M的磷酸鹽緩沖溶液中的。

步驟(1)中，所述超聲處理的時(shí)間為1～5min，超聲頻率為20KHz。

所述慶大霉素液相芯片探針是被懸浮于貯存液中保藏的，所述貯存液為pH值為7.2～8.0，濃度為0.05M～0.2M的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，其含0.1～1.0wt％牛血清白蛋白、0.01～0.05wt％吐溫-20和0.1wt％疊氮鈉。

所述磷酸緩沖鹽溶液為含0.8％wtNaCl的磷酸鹽緩沖液。

該方法具體為：