[發明專利]豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP7蛋白的表達及檢測方法

無效

• 申請號: 201010278518.3
• 申請日: 2010-09-10
• 公開（公告）號: CN101948515A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 劉婷婷;李玉峰;姜平
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C07K14/08
• 分類號: C07K14/08;C12N15/40;C12N15/63;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP7重組蛋白，是通過以下方法表達獲得的：

1.1NSP7基因的擴增、克隆和鑒定

設計兩對引物，

上游引物P1：CATGGATCCTCGCTGACTGGTGCC，

下游引物P2：TAGCGGCCGCTTATTCCCACTGAGCTCTTCTA；

分別引入Not?I和BamH?I酶切位點，以PRRSV的cDNA產物為模板進行PCR擴增，獲得NSP7蛋白目的基因條帶，將擴增的目的條帶克隆至pET-28a載體，獲得重組質粒pET-28a-NSP7；

1.2NSP7蛋白的表達和純化將重組質粒pET-28a-NSP7轉化入大腸桿菌BL21中，涂布氨芐青霉素抗性培養皿，37℃過夜培養；挑取單個菌落接種3毫升LB培養基，37℃過夜振蕩培養；第二天取1％的過夜培養物接種新鮮LB培養基，當細菌濃度OD600達到0.4～0.6時，加入終濃度1.5mmol/L?IPTG，誘導4h誘導表達基因工程重組菌500ml，離心收集菌體，誘導后的細菌按每100mL菌液加入5mL?PBS重懸菌體沉淀，經超聲裂解后，按按照Invitrogen公司Ni-NTA試劑盒說明書進行親和層析純化，收獲NSP7重組蛋白。

2.用權利要求1所述NSP7蛋白建立的ELISA檢測方法，包括：

1)用權利要求1所述的重組NSP7蛋白包被ELISA板，2％牛血清白蛋白(BSA)封閉；

2)對待檢血清用PBS進行1∶100稀釋后，每孔加入稀釋后的待檢血清100微升，37℃作用1小時，PBST洗滌5次；

2)對酶標二抗用PBS進行1∶20000稀釋后，每孔加入100微升稀釋的酶標二抗，37℃作用0.5小時，PBST洗滌5次；

3)加入底物TMB進行顯色，37℃顯色作用10分鐘，然后用50微升2M的硫酸終止；

4)于450nm波長測定OD值，經統計學分析，得到OD450平均值X和標準差SD；

5)結果判定血清樣品S/P≥X+3SD者判為陽性，S/P≤X+2SD者判為陰性，介于兩者判為可疑，S待檢樣品的OD值，P陽性對照的OD值。