[發明專利]豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP7蛋白的表達及檢測方法

無效

• 申請號: 201010278518.3
• 申請日: 2010-09-10
• 公開（公告）號: CN101948515A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 劉婷婷;李玉峰;姜平
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C07K14/08
• 分類號: C07K14/08;C12N15/40;C12N15/63;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

一.技術領域

本發明豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP7蛋白的表達和ELISA抗體檢測方法的建立屬于生物技術高科技領域，專用于檢測豬群中豬繁殖與呼吸綜合征病毒的感染情況和豬群中弱毒疫苗免疫后的抗體變化情況。

二、背景技術

國內外有關PRRS血清抗體的診斷方法有免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)、間接熒光抗體試驗(IFA)、血清中和試驗(SN)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、乳膠凝集實驗(LAT)等^[8，9]。其中以ELISA因具有高度的敏感性和特異性，適用于大規模的檢測，方便易行，操作過程及結果判定易于標準化應用等優點應用最為廣泛。

到目前為止，PRRSV抗體檢測的ELISA方法均以綜合處理的結構蛋白或全病毒作為包被抗原。2009年，Elizabeth?Brown等^[10]試驗以非結構蛋白作為包被抗原檢測I型和II型PRRSV抗體。研究發現NSP1、NSP2和NSP7具有較好的免疫原性，并研究了針對不同非結構蛋白的抗體產生規律，建立了以重組非結構蛋白NSP1、NSP2、NSP4、NSP7和NSP8作為包被抗原的間接ELISA檢測方法。其中NSP7抗體在感染后14天可以檢測到并持續至202天以后，與IDEXX抗體消長曲線類似。I型和II型NSP7抗體檢測結果與IDEXX?HerdChek?PRRS?2XR?ELISA的符合率分別為98.3％和99.3％。從而證明PRRSV非結構蛋白NSP7在抗體檢測中也有較好的應用前景。

三、發明內容

技術問題本發明的目的是用原核表達系統對豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP7蛋白進行表達，然后對表達蛋白進行純化后建立ELISA檢測方法。

技術方案本發明的實施方案如下：

豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP7蛋白的表達和ELISA檢測方法的建立，其特征在于，用原核系統表達的NSP7蛋白具有表達量高，經親和層析純化后純度高，完全可以作為包被抗原建立檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA方法。用表達蛋白建立的ELISA方法與其他ELISA方法進行比較，具有高度的敏感性和特異性，具有發展為商品化試劑盒的前景。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP7蛋白的表達和ELISA檢測方法的建，是通過以下方法構建而成的：

1.1NSP7基因的擴增、克隆和鑒定

設計兩對引物，

上游引物P?1：CATGGATCCTCGCTGACTGGTGCC，

下游引物P2：TAGCGGCCGCTTATTCCCACTGAGCTCTTCTA；

分別引入Not?I和BamH?I酶切位點，以PRRSV的cDNA產物為模板進行PCR擴增，獲得NSP7蛋白目的基因條帶，將擴增的目的條帶克隆如pET-28a載體，獲得重組質粒pET-28a-NSP7；

1.2NSP7蛋白的表達和純化將重組質粒pET-28a-NSP7轉化入大腸桿菌BL21中，涂布氨芐青霉素抗性培養皿，37℃過夜培養；挑取單個菌落接種3毫升LB培養基，37℃過夜振蕩培養；第二天取1％的過夜培養物接種新鮮LB培養基，當細菌濃度OD600達到0.4～0.6時，按終濃度1.5mmol/L?IPTG和誘導4h誘導表達基因工程重組菌500ml，離心收集菌體，誘導后的細菌按每100mL菌液加入5mL?PBS重懸菌體沉淀，經超聲裂解后，按按照Invitrogen公司Ni-NTA試劑盒說明書進行親和層析純化，收獲蛋白。

用所述NSP7蛋白建立的ELISA方法，包括：

1)用權利要求1所述的重組NSP7蛋白包被ELISA板，2％BSA封閉；

2)對待檢血清用PBS進行1∶100稀釋后，每孔加入稀釋后的待檢血清100微升，37℃作用1小時，PBST洗滌5次；

2)對酶標二抗用PBS進行1∶20000稀釋后，每孔加入100微升稀釋的酶標二抗，37℃作用0.5小時，PBST洗滌5次；

3)加入底物TMB進行顯色，37℃顯色作用10分鐘，然后用50微升2M的硫酸終止；

4)于450nm波長測定OD值，經統計學分析，得到OD450平均值X和標準差SD；

5)結果判定血清樣品S/P≥X+3SD者判為陽性，S/P≤X+2SD者判為陰性，介于兩者判為可疑，S待檢樣品的OD值，P陽性對照的OD值。

有益效果