[發明專利]利用顛茄托品酮還原酶I型基因提高顛茄莨菪烷類生物堿含量的方法

無效

• 申請號: 201010277722.3
• 申請日: 2010-09-09
• 公開（公告）號: CN102399795A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 廖志華;陳敏;楊春賢;張磊;唐克軒
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/82;C12N5/10;A01H5/00
• 代理公司: 重慶華科專利事務所 50123
• 代理人: 康海燕

技術領域

本發明屬于分子生物學、育種學以及基因工程等領域，為一種利用基因工程技術培育莨菪烷類生物堿（Tropane?alkaloids，TAs）高產的顛茄(Atropa?belladonna?L?.)的方法，具體涉及目的基因的克隆、表達載體的構建、獲得TAs高產的轉基因顛茄的具體過程。本發明還提供利用基因工程獲得的TAs高產的轉基因顛茄及其培養的子代、再生植株、植物組織或種子。

背景技術

莨菪烷類生物堿（Tropane?alkaloids，TAs）在臨床上應用廣泛。初期用于麻醉前給藥、抗暈動藥、治療帕金森癥以及改善微循環等，市場需求巨大。隨著對TAs藥理作用的研究深入，TAs逐漸廣泛用于戒毒脫癮、治療農藥中毒等。在原有巨大市場基礎上，隨著TAs新功能的不斷開發，其需求還在不斷迅速增長。

目前TAs都是從天然植物中提取，例如顛茄、莨菪、曼陀羅等茄科植物，其中顛茄是TAs最主要的商業栽培藥源。顛茄各部位均富含生物堿，主要為莨菪堿（hyoscyamine，C₁₇H₂₃O₃N）和東莨菪堿，但是天然的顛茄中TAs的量很低，而且東莨菪堿的含量比莨菪堿的含量要低得多。

TAs的基本代謝途徑已經研究得較為清楚。其生物合成的上游前體為多胺代謝物。其中，托品酮還原酶（tropinone?reductase，TR）是立體專一性依賴NADPH的還原酶，包括TR-I、TR-II兩種，形成了TAs生物合成的分支點，TR-I催化TA生物合成的中間產物托品酮還原成托品堿，TR-II催化托品酮還原成Ψ-托品（假托品堿），托品與來自于苯丙氨酸的托品酸反應，合成莨菪堿。

本發明采用基因工程方法在顛茄過量表達TR-I基因，從而達到打破顛茄中TAs生物途徑上的限速反應，最終培育出TAs高產的顛茄。

發明內容

本發明的第一目的是提供一種利用基因工程技術遺傳改良顛茄的方法，該方法將轉移來源于顛茄的TR-I基因核苷酸編碼區到顛茄中高效表達，從而提高顛茄中TAs的合成能力。

????在本發明的另一方面，還提供了一種植物表達載體，它包含上述顛茄的TR-I基因核苷酸的編碼區。

在本發明的另一方面，還提供了一種用上述植物表達載體轉化的宿主細胞。在實例中該宿主細胞是顛茄。

本發明的技術方案如下:

本發明分離出的一條DNA分子：為顛茄的TR-I基因的編碼區，用引物f-TR-I：5’-GAAGATCTATGGAAGAATCAAAAGATAACA-3’和r-TR-I：5’-GGGTGACCTAAAA?TCCACCATTAGCAGTG-3’可以從顛茄中擴增出來。

一種利用基因工程技術提高顛茄中TA含量的方法，特征在于利用攜帶顛茄的TR-I基因編碼區的植物表達載體，采用任何轉基因方法在顛茄細胞、組織、器官、植株中過量表達TR-I，從而提高顛茄中TAs生物合成能力。其步驟如下：

（1）采用基因克隆的方法獲得顛茄的TR-I基因編碼區，即TR-I基因核苷酸的編碼區：克隆顛茄TR-I基因編碼區的引物為：f-TR-I：5’-?GAAGATCTATGGAAGAATCAAAAGATAA?CA?-3’，作為上游引物，攜帶Bgl?II酶切位點；r?f-TR-I：5’-?GGGTGACCTAAAATCCACCATTAGCAGT?G-3’，作為下游引物，攜帶BstE?II酶切位點；

（2）把顛茄的TR-I基因編碼區連于表達調控序列，形成植物表達載體；

（3）獲得顛茄的無菌外植體；

（4）采用任何轉基因方法轉移顛茄的TR-I基因編碼區到顛茄細胞、組織、器官、植株中；

（5）在特定的條件下篩選和鑒定顛茄轉化子；

（6）在適合的條件下培養的轉基因的顛茄，獲得轉基因后代。

本發明涉及的植物表達載體包含顛茄的TR-I基因編碼區的DNA。

用上述方法獲得的生命體，它是轉基因的顛茄的細胞、組織、器官、植株，導入了在CaMV?35S啟動子驅動下的顛茄TR-I基因編碼區，其TR-I表達水平得到大大提高，TAs合成能力得到大大提高，TAs含量也得到大大提高。

在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒等。在本發明中，術語“生命體”指顛茄的細胞、組織、器官、植株。