[發明專利]利用顛茄托品酮還原酶I型基因提高顛茄莨菪烷類生物堿含量的方法

無效

• 申請號: 201010277722.3
• 申請日: 2010-09-09
• 公開（公告）號: CN102399795A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 廖志華;陳敏;楊春賢;張磊;唐克軒
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/82;C12N5/10;A01H5/00
• 代理公司: 重慶華科專利事務所 50123
• 代理人: 康海燕

1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括：具有編碼顛茄托品酮還原酶（tropinone?reductase，TR）I型（TR-I）基因核苷酸序列的編碼區，采用引物f-TR-I：5’-GAAGATCTATGGAAGAATCAAAAGATAACA-3’和r-TR-I：5’-GGGTGACCTAAAA?TCCACCATTAGCAGTG-3’從顛茄中擴增出來。

2.一種植物表達載體，它包含上述顛茄的TR-I基因核苷酸的編碼區。

3.一種利用基因工程技術提高顛茄中莨菪烷類生物堿含量的方法，特征在于構建攜帶權利要求1中的DNA分子的植物高效表達載體，采用轉基因方法在顛茄細胞、組織、器官、植株中過量表達權利1中的DNA分子，其步驟如下：

（1）采用基因克隆方法獲得來源于顛茄的的TR-I基因的編碼區，即TR-I基因核苷酸的編碼區：克隆顛茄TR-I基因編碼區的引物為：f-TR-I：5’-?GAAGATCTATGGAAGAATCAAAAGATTA?CA?-3’，作為上游引物，攜帶Bgl?II酶切位點；r?f-TR-I：5’-?GGGTGACCTAAAATCCACCATTAGCAGT?G-3’，作為下游引物，攜帶BstE?II酶切位點；

（2）把來源于顛茄的TR-I基因核苷酸的編碼區連于表達調控序列，形成高效植物表達載體；?

（3）獲得顛茄無菌外植體；

（4）采用轉基因方法轉移來源于顛茄的TR-I基因的編碼區到顛茄細胞、組織、器官、植株中；

（5）篩選和鑒定轉化子：在離體培養的條件下用抗生素卡那霉素、潮霉素或G418選擇出有抗生素和草胺膦、草甘膦抗性的顛茄的轉化子；使用PCR、Southern雜交、Northern雜交或Western印跡方法來鑒定顛茄的轉化子；

（6）培養轉化子，獲得轉基因后代：對經過鑒定的轉化子離體培養，并檢測TR-I基因的表達水平，篩選TAs高產的優良轉化子進行培養，獲得轉基因后代。

4.一種用權利要求2所述的植物表達載體轉化的宿主細胞，該宿主細胞是顛茄。