[發明專利]模擬折疊酶功能的小分子化合物N-烷基酰胱胺、制備方法及用于輔助蛋白質氧化復性的方法

有效

• 申請號: 201010276124.4
• 申請日: 2010-09-08
• 公開（公告）號: CN101921216A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 孫彥;王國珍;史清洪;董曉燕
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C07C323/41
• 分類號: C07C323/41;C07C319/22;C07K1/00
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

技術領域

本發明涉及一種模擬折疊酶功能的小分子化合物和其合成方法，及其在輔助蛋白質氧化復性中的使用方法，屬于生物技術中的蛋白質復性技術領域。

背景技術

蛋白質折疊復性不僅與人類的一些疾病相關，而且也是應用基因重組技術生產貴重醫藥蛋白質的瓶頸。因此，蛋白質折疊復性技術是目前研究的熱點。很多重要的醫藥蛋白質都是含有二硫鍵的，例如人生長激素、人干擾素、腫瘤壞死因子、胰島素、白細胞介素、組織型纖溶酶原激活劑等。這些含二硫鍵蛋白質的折疊復性則是蛋白質復性中的一個巨大挑戰。這種含有二硫鍵的蛋白質的折疊過程被稱作氧化復性，在此過程中蛋白質不但要形成正確的三級結構，而且多個半胱氨酸殘基要準確配對形成正確的二硫鍵。在體內，此過程是受到氧化還原酶催化的。在真核細胞內質網上的二硫鍵異構酶(PDI)以及原核菌體細胞周質中的DsbA可以有效地輔助蛋白質折疊過程中二硫鍵的形成。這些酶不但具有特殊的共同序列CXXC(C，半胱氨酸；X，任何氨基酸殘基)、較低的pKa值和合適的氧化還原勢，而且與變性蛋白質具有特異的相互作用。但是，直接將PDI和DsbA作為氧化劑應用于蛋白質的氧化復性則存在價格比較昂貴、不穩定、難于分離的問題，不適宜于應用于大規模生產。所以針對實際生產，有必要開發此類折疊酶的小分子模擬物。

目前，人們基于PDI物理性質如CXXC序列、較低的pKa值和合適的氧化還原勢而設計了一些巰基小分子模擬物來輔助復性，如芳香巰醇、(±)-反-1，2-二(2-乙酰巰基)環己烷(BMC)、CXXC類似多肽序列(Small-molecule?catalysts?of?oxidative?protein?folding.Current?Opinion?in?Chemical?Biology，2008，12，740-745.)。這些模擬PDI功能的小分子化合物能夠在一定程度上提高蛋白質氧化復性的速率和收率。但是，得到的小分子模擬物的催化效果遠遠低于實際折疊酶的作用，達到輔助復性的效果需要很高的濃度。另外，這些小分子不能夠有效地模擬PDI和DsbA對變性蛋白質的特異性相互作用。由于這些小分子模擬物以及最為常用的氧化還原劑，氧化型谷胱甘肽(GSSG)和還原型谷胱甘肽(GSH)都不具有?蛋白質氧化特異性，很容易被強還原劑二硫蘇糖醇(DTT)還原，所以，應用這些小分子輔助蛋白質復性時都需要將還原變性蛋白質中殘留的還原劑二硫蘇糖醇先通過凝膠過濾色譜或透析的操作除去，這樣就使得復性過程操作復雜。

為了克服常用氧化劑輔助復性的不足，本發明提出了一種新型的模擬折疊酶功能的小分子化合物及其輔助蛋白質復性的方法，氧化劑用量大大減少，而且操作簡單，不需要將變性劑分離的操作步驟，節省復性時間和成本。

發明內容

本發明的目的在于提供一種模擬折疊酶功能的小分子化合物N-烷基酰胱胺，并建立其輔助含有二硫鍵蛋白質的高效氧化復性的技術方法。本方法無需對變性蛋白質進行去除還原劑的操作，直接應用所設計的N-烷基酰胱胺作為氧化劑與殘留的還原劑耦合形成氧化還原對，在強還原性的溶液中高效地輔助蛋白質的復性。

本發明是通過下述技術方案加以實現的。

一種模擬折疊酶功能的小分子化合物N-烷基酰胱胺，其特征在于，N-烷基酰胱胺是胱胺分子中一端的氨基，通過酰胺化反應與脂肪酸的羧基偶聯而形成，N-烷基酰胱胺結構形式表達如下：

其中：R為含有4～7個碳原子的烷基鏈；

上述的脂肪酸選自戊酸、己酸、庚酸和辛酸。

本發明的一種N-烷基酰胱胺的制備方法，步驟如下：

1)將胱胺二鹽酸鹽用去離子水溶解，得到0.05-1mol/L胱胺溶液后，加入含有5-8個碳原子的脂肪酸，脂肪酸的摩爾濃度為胱胺摩爾濃度的0.02-0.5倍，混合后，用NaOH將其pH調至5.5-6.5；

2)向上述制得的液體中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽固體粉末，使固體粉末摩爾濃度為脂肪酸摩爾濃度的5-100倍；

3)將上述反應體系置于15-30℃恒溫水浴搖床，反應3-6小時，得到N-烷基酰胱胺粗產物；

4)將粗產物首先用0.45μm的水系微孔濾膜過濾，然后用C18反相色譜柱進行分離，收集的組分經冷凍干燥得到N-烷基酰胱胺。