[發明專利]RSV和RBSDV的RNA干涉載體、構建方法及應用

無效

• 申請號: 201010276101.3
• 申請日: 2010-11-01
• 公開（公告）號: CN101974550A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 李莉;李紅偉;王錫鋒;劉艷;吳蓓蕾
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 胡敬紅

1.RSV和RBSDV的RNA干涉載體，包括骨架載體和含有正、反義鏈的發夾結構，其特征在于：以串聯的RSV和RBSDV特異性核苷酸序列為正、反義鏈，所述串聯的RSV和RBSDV特異性核苷酸序列如SEQ?ID?NO1。

2.根據權利要求1所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體，所述骨架載體為pMCG161載體。

3.根據權利要求2所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體，所述正義鏈插入在酶切位點AscI和AvrII間，反義鏈插入在酶切位點SpeI和SacI之間。

4.根據權利要求1所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體，所述骨架載體為去掉潮霉素抗性基因的pCMBIA1301載體。

5.根據權利要求4所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體，所述發夾結構為權利要求3的干涉載體經BamHI、HindIII酶切得到。

6.權利要求3所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體的構建方法，步驟如下：

(1)得到如序列SEQ?ID?NO1所示的串聯的RSV和RBSDV特異性核苷酸片段；(2)將步驟(1)的基因部分片斷經AscI、AvrII雙酶切后，與同樣經AscI、AvrII酶切的載體pMCG161連接，得到插入正向目的片段的重組質粒pMCG161+D；再將步驟(1)的基因部分片斷經SpeI、SacI雙酶切，與經SpeI、SacI酶切的載體pMCG161+D連接，即可得到插入正反義鏈的RNA干涉載體pMCG161+/-B。

7.根據權利要求6所述的構建方法，所述步驟(1)采用如下步驟方式：(1)以感染水稻條紋病毒RSV水稻總RNA為模板，以SEQ?ID?NO2和SEQ?ID?NO3所示序列為引物對，經RT-PCR擴增得到PCR產物I，

SEQ?ID?NO2：5’-AGACTAGT?GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3’，

SEQ?ID?NO3：5’-AGTCTTATGTCAGCCATTAACAGCCATCTTAACACCAG-3’；

(2)以感染水稻黑條矮縮病毒RBSDV水稻總RNA為模板，以SEQ?ID?NO4和SEQ?IDNO5所示序列為引物對，經RT-PCR擴增得到PCR產物II，

SEQ?ID?NO4：5’-CTGGTGTTA?AGATGGCTGTTAATGGCTGACATAAGACTC-3’，

SEQ?ID?NO5：5’-AGGAGCTC?CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3’；

(3)以PCR產物I和II的1∶1混合物為模板，以SEQ?ID?NO2和SEQ?ID?NO5為引物對，經PCR擴增得到PCR產物III，

SEQ?ID?NO2：5’-AGACTAGT?GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3’，

SEQ?ID?NO5：5’-AGGAGCTC?CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3’。

(4)以PCR產物III為模板，以SEQ?ID?NO2和SEQ?ID?NO5為引物對，經PCR擴增得到串聯的RSV和RBSDV特異性核苷酸片段。

8.權利要求5所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體的構建方法，步驟如下：(1)用限制性內切酶XhoI酶切pCMBIA1301載體，得到去除潮霉素標記基因的pCMBIA1301載體，即pCMBIA1301-hpt^-：(2)將權利要求3所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體用BamHI、HindIII酶切，得到的發夾結構連入pCMBIA1301-hpt^-，得到無標記基因的RNA干涉載體pCMBIA1301+/-D。

9.權利要求1-5任一所述的干涉載體在轉基因植物中的應用。

10.根據權利要求9所述的應用，為將權利要求1-5任一所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體轉化有關受體植物，使之對水稻條紋病毒和黑條矮縮病毒同時產生抗性。

11.根據權利要求10所述的應用，所述干涉載體為權利要求3所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體，所述轉化的方法為基因槍法。