[發明專利]RSV和RBSDV的RNA干涉載體、構建方法及應用

無效

• 申請號: 201010276101.3
• 申請日: 2010-11-01
• 公開（公告）號: CN101974550A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 李莉;李紅偉;王錫鋒;劉艷;吳蓓蕾
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 胡敬紅

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，特別是涉及一種適合單子葉植物遺傳轉化、兼抗兩種病毒病的RNA干涉載體的構建及其在水稻上應用。更進一步涉及到水稻條紋病毒(RSV)外殼蛋白(CP)基因和水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)S10部分核苷酸序列的表達載體，及其遺傳轉化禾本科植物水稻并獲得抗性植株的方法。

背景技術

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，在我國水稻占糧食生產和消費的40％，其在糧食安全和國民經濟中占有舉足輕重的作用。由水稻條紋病毒(Rice?stripe?virus，RSV)引起水稻條紋葉枯病是我國粳稻種植區最重要的水稻病毒病害。流行年份，一般田塊減產20％～30％，嚴重田塊達到80％以上，甚至顆粒無收。該病在江蘇、安徽、河南和山東等地，曾于2001、2004、2005、2006、2007年連續爆發成災。2004年在江蘇、河南等病田率達75％以上，部分病重田的病穴率達90％以上；2005年，僅江蘇省發病面積就達2800萬畝，給當地水稻生產造成巨大損失。2006～2009年華北和東北稻區也呈現擴大趨勢，據農業部有關部門估計2008年發病面積可達2800～3000萬畝，2009年發病面積可達與2008年持平，2010年仍將為偏重發生年份(www.agri.gov.cn)。

自2000年以來，在江蘇、浙江、福建、江西等稻區，由水稻黑條矮縮病毒(Rice?black?streaked?dwarf?virus，RBSDV)引起的稻黑條矮縮病沉寂多年后再度爆發流行，流行地區約60％的稻田發病，一般田塊株發病率10～30％，嚴重田塊可高達40～80％以上。2004年，在浙江省中南部雜交稻種植區發病面積80萬畝，僅臺州市發病面積就達48萬畝，占水稻播種面積的33％，損失產量2萬余噸。2006～2007年在江蘇桐城、鹽城、泰州等地區的華粳6號、淮稻5號、II優084等水稻品種上，病株率一般在20-30％，嚴重的在80％左右，有的重病田病株率甚至高達90％以上，目前已擴展到湖南、山東等地，因此該病已成為威脅我國水稻生產的又一重要的病毒病。

這兩種病毒還可以侵染我國的主要糧食作物玉米和小麥，由水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)引起的玉米粗縮病是威脅玉米生產的重要病毒病害。

流行學研究結果表明這些病害暴發、流行的主要原因是品種抗性的喪失和有效傳毒介體種群數量的上升。由于抗病品種在品質上的不足，導致感病品種的大面積種植，加之灰飛虱傳毒的瞬時性和持久性、病毒病防治藥劑缺乏，使得防蟲治病十分困難，農藥的使用也存在許多弊病，因此最為經濟有效的途徑是利用品種自身的抗性達到主動防治病毒病害目的。然而傳統的育種方法由于缺乏理想的抗源(國內尚未發現抗黑條矮縮病毒的種質資源)，抗病基因又多與劣質基因相伴隨，獲得抗病、高產優質的雙重特性品種的難度很大。

RNA干涉(RNA?interference，RNAi)是近年來發現的一種重要基因沉默現象，它是指通過雙鏈RNA的介導的特異性的降解對應序列的mRNA，從而特異性地抑制相應基因的表達，是植物對外來入侵者的一種重要的防御機制。本實驗室對RSV田間分離物外殼蛋白(CP)的研究表明，我國北方粳稻產區所發生的RSV?CP基因非常保守，同源性達96.7～100％，有利于siRNA的識別。本發明以近年在我國北方地區嚴重發生的水稻條紋病毒(RSV)和黑條矮縮病毒(RBSDV)為對象，利用植物轉基因工程技術將RSV?CP和RBSDV?S10的部分核苷酸導入水稻，通過其特異地干擾、降解或沉默RSV和RBSDV病毒基因在水稻植株內的正常復制、積累和傳播，篩選獲得分別或同時抗RSV、RBSDV的水稻品系，為進一步結合常規育種工作，改良現有的優質高產但不抗病的水稻品種，以便實現利用轉基因技術獲得免疫或高抗RSV和RBSDV的水稻新品系的目的。

發明內容

基于上述目的，本發明提供了可用于農桿菌和基因槍遺傳轉化單子葉植物的2種含有水稻條紋病毒(RSV)和水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)基因的RNA干涉(RNAi)載體，這些載體分別包含致病病毒RSV的CP基因部分核苷酸序列(RSV-HCP)和致病病毒RBSDV的S10部分片段(RBSDV-HS10)。

本發明還提供這些干涉病毒基因表達載體的構建方法及應用，為植物抗病育種工程提供了一種新的策略和思路。

RSV和RBSDV的RNA干涉載體，包括骨架載體和含有正、反義鏈的發夾結構，其特征在于：以串聯的RSV和RBSDV特異性核苷酸序列為正、反義鏈，所述串聯的RSV和RBSDV特異性核苷酸序列如SEQ?ID?NO1。