[發明專利]水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體、構建方法及應用

無效

• 申請號: 201010276096.6
• 申請日: 2010-11-01
• 公開（公告）號: CN101967491A
• 公開（公告）日: 2011-02-09
• 發明（設計）人: 李莉;李紅偉;王錫鋒;劉艷;吳蓓蕾
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 胡敬紅

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，特別是涉及一種適合單子葉植物遺傳轉化、的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體、構建方法及其在水稻上應用。

背景技術

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，在我國水稻占糧食生產和消費的40％，其在糧食安全和國民經濟中占有舉足輕重的作用。自2000年以來，在江蘇、浙江、福建、江西等稻區，由水稻黑條矮縮病毒(Rice?black?streaked?dwarf?virus，RBSDV)引起的稻黑條矮縮病沉寂多年后再度爆發流行，流行地區約60％的稻田發病，一般田塊株發病率10～30％，嚴重田塊可高達40～80％以上。2004年，在浙江省中南部雜交稻種植區發病面積80萬畝，僅臺州市發病面積就達48萬畝，占水稻播種面積的33％，損失產量2萬余噸。2006～2007年在江蘇桐城、鹽城、泰州等地區的華粳6號、淮稻5號、II優084等水稻品種上，病株率一般在20-30％，嚴重的在80％左右，有的重病田病株率甚至高達90％以上，目前已擴展到湖南、山東等地，因此該病已成為威脅我國水稻生產的又一重要的病毒病。該病毒還可以侵染我國的主要糧食作物玉米和小麥，由水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)引起的玉米粗縮病是威脅玉米生產的重要病毒病害。

流行學研究結果表明該病害暴發、流行的主要原因是品種抗性的喪失和有效傳毒介體種群數量的上升。由于灰飛虱傳毒的瞬時性和持久性、病毒病防治藥劑缺乏，使得防蟲治病十分困難，農藥的使用也存在許多弊病，因此最為經濟有效的途徑是利用品種自身的抗性達到主動防治病毒病害目的。然而傳統的育種方法由于缺乏理想的抗源(國內尚未發現抗黑條矮縮病毒的種質資源)，獲得抗病、高產優質的雙重特性品種的難度很大。

RNA干涉(RNA?interference，RNAi)是近年來發現的一種重要基因沉默現象，它是指通過雙鏈RNA的介導的特異性的降解對應序列的mRNA，從而特異性地抑制相應基因的表達，是植物對外來入侵者的一種重要的防御機制。本發明以近年在我國嚴重發生的黑條矮縮病毒(RBSDV)為對象，利用植物轉基因工程技術將RBSDV?S10的部分核苷酸導入水稻，通過其特異地干擾、降解或沉默RBSDV病毒基因在水稻植株內的正常復制、積累和傳播，篩選獲得抗RBSDV的水稻品系，為進一步結合常規育種工作，改良現有的優質高產但不抗病的水稻品種，以便實現利用轉基因技術獲得免疫或高抗RBSDV的水稻新品系的目的。

發明內容

基于上述目的，本發明提供了可用于農桿菌和基因槍遺傳轉化單子葉植物的2種含有水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)基因的RNA干涉(RNAi)載體，這些載體分別包含致病病毒RBSDV的S10部分片段(RBSDV-HS10)。

本發明還提供這些干涉病毒基因表達載體的構建方法及應用，為植物抗病育種工程提供了一種新的策略和思路。

水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體，包括骨架載體和含有正、反義鏈的發夾結構，其特征在于：以RBSDV的S10部分片段為正、反義鏈，所述RBSDV的S10部分片段的序列如SEQ?ID?NO3。

所述骨架載體為pMCG161載體，所述正義鏈插入在酶切位點AscI和AvrII間，反義鏈插入在酶切位點SpeI和SacI之間，命名為pMCG161+/-B，其結構如圖6A所示。

所述骨架載體為去掉潮霉素抗性基因的pCMBIA1301載體，所述發夾結構為干涉載體pMCG161+/-B經BamHI、HindIII酶切得到的，命名為pCMBIA1301+/-B，其結構如圖6B所示。

pMCG161+/-B干涉載體的構建方法，步驟如下：

(1)得到如序列SEQ?ID?NO3所示的RBSDV的S10部分片段；(2)將步驟(1)的基因部分片斷經AscI、AvrII雙酶切后，與同樣經AscI、AvrII酶切的載體pMCG161連接，得到插入正向目的片段的重組質粒pMCG161+B；再將步驟(1)的基因部分片斷經SpeI、SacI雙酶切，與經SpeI、SacI酶切的載體pMCG161+B連接，即可得到插入正反義鏈的RNA干涉載體pMCG161+/-B。

所述步驟(1)采用如下方式：以感染水稻黑條矮縮病毒RBSDV水稻總RNA為模板，以SEQ?ID?NO1和SEQ?ID?NO2所示序列為引物對，經RT-PCR擴增得到，

SEQ?ID?NO1：5’-AGACTAGT?GGCGCGCCTAATGGCTGACATAAGACTC-3’，