[發明專利]水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體、構建方法及應用

無效

• 申請號: 201010276096.6
• 申請日: 2010-11-01
• 公開（公告）號: CN101967491A
• 公開（公告）日: 2011-02-09
• 發明（設計）人: 李莉;李紅偉;王錫鋒;劉艷;吳蓓蕾
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 胡敬紅

1.水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體，包括骨架載體和含有正、反義鏈的發夾結構，其特征在于：以RBSDV的S10部分片段為正、反義鏈，所述RBSDV的S10部分片段的序列如SEQ?ID?NO3。

2.根據權利要求1所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體，所述骨架載體為pMCG161載體。

3.根據權利要求2所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體，所述正義鏈插入在酶切位點AscI和AvrII間，反義鏈插入在酶切位點SpeI和SacI之間。

4.根據權利要求1所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體。所述骨架載體為去掉潮霉素抗性基因的pCMBIA1301載體。

5.根據權利要求1所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體，所述發夾結構為權利要求3所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體經BamHI、HindIII酶切得到。

6.根據權利要求1所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體的構建方法，步驟如下：

(1)得到如序列SEQ?ID?NO3所示的RBSDV的S10部分片段；

(2)將步驟(1)的基因部分片斷經AscI、AvrII雙酶切后，與同樣經AscI、AvrII酶切的載體pMCG161連接，得到插入正向目的片段的重組質粒pMCG161+B；再將步驟(1)的基因部分片斷經SpeI、SacI雙酶切，與經SpeI、SacI酶切的載體pMCG161+B連接，即可得到插入正反義鏈的RNA干涉載體pMCG161+/-B。

7.根據權利要求6所述的方法，所述步驟(1)采用如下方式：以感染水稻黑條矮縮病毒RBSDV水稻總RNA為模板，以SEQ?ID?NO1和SEQ?ID?NO2所示序列為引物對，經RT-PCR擴增得到，

SEQ?ID?NO1：5’-AGACTAGT?GGCGCGCCTAATGGCTGACATAAGACTC-3’，

SEQ?ID?NO2：5’-AGGAGCTC?CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3’。

8.權利要求5所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體的構建方法，步驟如下：(1)用限制性內切酶XhoI酶切pCMBIA1301載體，得到去除潮霉素標記基因的pCMBIA1301載體，即pCMBIA1301-hpt^-；(2)將權利要求3所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體用BamHI、HindIII酶切，得到的發夾結構連入pCMBIA1301-hpt^-，得到無標記基因的RNA干涉載體pCMBIA1301+/-B。

9.權利要求1-5任一所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體在轉基因植物中的應用。

10.根據權利要求9所述的應用，為將權利要求1-5任一所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體轉化有關受體植物，使之對水稻黑條矮縮病毒產生抗性。

11.根據權利要求10所述的應用，所述干涉載體為權利要求3所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體，所述轉化的方法為基因槍法。

12.根據權利要求10所述的應用，所述干涉載體為權利要求5所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體，所述轉化的方法為農桿菌介導法。

13.根據權利要求12所述的應用，所述農桿菌為根瘤農桿菌菌株EHA105。

14.根據權利要求10所述的應用，所述受體植物為禾本科植物。

15.根據權利要求14所述的應用，所述禾本科植物為水稻。

16.根據權利要求15所述的應用，所述水稻品種為愛知旭或皖粳97。