[發明專利]嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶

有效

• 申請號: 201010276051.9
• 申請日: 2010-09-07
• 公開（公告）號: CN101948853A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 曹以誠;周毅;杜正平
• 申請（專利權）人: 廣州華峰生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/63;C12N9/12;C12N15/10;C07K19/00
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

技術領域

本發明涉及DNA聚合酶，具體涉及一種嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶、基因、質粒、融合蛋白、用途和嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的制備方法。

背景技術

DNA是大多數生物物種的遺傳物質。DNA聚合酶的功能主要是進行DNA復制和修復。目前已經克隆了多種生物物種的DNA聚合酶，包括一些嗜熱生物的DNA聚合酶。從嗜熱生物中分離的DNA聚合酶具有較高的熱穩定性，例如從Thermus?aquaticus中獲得的Taq?DNA聚合酶在95℃的半衰期為1.6小時。

環介導恒溫擴增技術(loop-mediated?isothermal?amplication?of?DNA，簡稱LAMP)是在恒溫(63～65℃)條件下45～90分鐘內完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環使所需儀器簡單化，克服了傳統PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本高等缺點。而且，這種檢測方法對檢測人員的技術素質要求較低，實際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。因此需要尋找一種DNA聚合酶來適應LAMP檢測方法。

發明內容

本發明的一個發明目的在于解決現有技術的不足之處而提供一種嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的基因。

一種嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的基因，所述的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶基因的核苷酸編碼序列如SEQ?ID?NO?1所示。

本發明的另一個發明目的在于解決現有技術的不足之處而提供一種質粒。

一種含有上述嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的基因的質粒pMal-c5x/bst。

pMal系統是一種高效的蛋白融合表達及純化系統。pMal載體含有編碼麥芽糖結合蛋白(Maltose?Binding?Protein，MBP)的大腸桿菌mal?E基因，其下游的多克隆位點便于目的基因插入，表達N端帶有MBP的融合蛋白(1，2，3)。通過″Ptac″強啟動子和mal?E翻譯起始信號使克隆基因獲得高效表達，并利用MBP對麥芽糖的特異性結合實現融合蛋白的一步親和純化。

此系統的pMal載體在鄰近多克隆位點處含有一段編碼特異性蛋白酶識別位點的序列，從而便于純化后將目的蛋白與MBP切割分離(5)。為了實現這個目的，多克隆位點中有一個限制性內切酶識別位點正好位于特異性蛋白酶識別位點處，同時也是目的基因插入的位點。

pMal系列載體可從1升的培養液中表達出100mg的融合蛋白。大部分情況下，表達出的融合蛋白是可溶的，因為MBP已經被證實可提高大腸桿菌中表達蛋白的可溶性(6)。盡管沒有一種表達系統適用于所有基因克隆，但pMal蛋白融合表達和純化系統經證實：在被檢測的已知蛋白中，有超過75％能表達出穩定產量。Current?Protocols?in?Molecular?Biology(3)中有一章對pMal載體的使用作了深入分析。

本發明采用該表達系統可以表達麥芽糖結合蛋白與嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的融合蛋白。所表達的融合蛋白可以用直鏈淀粉親和層析進行純化，所得產物純度很高。另外，據報道麥芽糖結合蛋白可以提高融合蛋白的可溶性，有利于融合蛋白的純化。

本發明的另一個發明目的在于解決現有技術的不足之處而提供一種DNA聚合酶。

一種嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶，所述的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO?2所示。

由于嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的熱穩定性較強，并且具有較高的鏈置換活性因此能夠用于高溫測序和核酸等溫擴增。本發明嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶在65℃的半衰期為8分鐘。

本發明還提供了上述的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶在核酸擴增反應的應用。

本發明的另一個發明目的在于解決現有技術的不足之處而提供一種融合蛋白。

一種融合蛋白，其具有上述的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶，所述的融合蛋白還具有麥芽糖結合蛋白。

所表達的融合蛋白可以用直鏈淀粉親和層析進行純化，所得產物純度很高。另外，麥芽糖結合蛋白可以提高融合蛋白的可溶性，有利于融合蛋白的純化。

本發明還提供了上述的融合蛋白在嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶純化的應用。

本發明還提供了一種嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的制備方法，所述的純化方法包括如下步驟：

(1)擴增如SEQ?ID?NO?1所示的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶基因的核苷酸編碼序列；