[發(fā)明專利]杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010275858.0
• 申請(qǐng)日: 2010-09-07
• 公開（公告）號(hào): CN101983556A
• 公開（公告）日: 2011-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳金慧;周小紅;施季森
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及林業(yè)中的種苗繁殖生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種誘導(dǎo)杉木優(yōu)樹雜交組合的未成熟合子胚胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)(Embryonal?Suspensor?Mass，簡(jiǎn)稱ESM)離體增殖，發(fā)育成完整體細(xì)胞胚并再生植株的方法。

背景技術(shù)

杉木(Cunninghamia?lanceolata(Lamb.)Hook)隸屬杉科(Taxodiaceae)杉木屬(Cunninghamia)，是我國(guó)特有的常綠針葉樹種之一。杉木生長(zhǎng)快，干形通直圓滿，又以良好的材性，美觀的木材紋理著稱，用途十分廣泛，是我國(guó)重要的商品用材造林樹種。自1960年代以來，杉木良種選育研究，已培育出一大批優(yōu)良種源、家系和優(yōu)良無性系供造林使用，為我國(guó)速生豐產(chǎn)林建設(shè)作出了重要貢獻(xiàn)。但由于造林面積的迅速增加，社會(huì)上對(duì)杉木優(yōu)良種苗的需求極為迫切。然而由于近10多年來受到氣候異常和杉木種實(shí)害蟲的危害，杉木種子園的種子產(chǎn)量，大小年的現(xiàn)象嚴(yán)重，良種種子產(chǎn)量和播種品質(zhì)不穩(wěn)定。杉木良種種苗的供應(yīng)不足，嚴(yán)重地制約著杉木人工林的發(fā)展。因此，有必要研發(fā)杉木優(yōu)良種質(zhì)資源的無性快速繁殖。體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)具有繁殖速度快，培養(yǎng)周期短，生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢(shì)，這給解決杉木優(yōu)良種苗的繁育瓶頸和商業(yè)化和工廠化生產(chǎn)提供了技術(shù)支撐。

被子植物體胚的發(fā)生和植株再生的思想，源于1902年Haberlandt提出的植物細(xì)胞具有全能性的概念，即植物體的每一個(gè)細(xì)胞都具有發(fā)育成為一個(gè)新個(gè)體的潛在能力。在人工培養(yǎng)條件下，植物體細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化形成如有性生殖合子胚那樣的胚狀結(jié)構(gòu)(胚狀體)，進(jìn)而通過覆被人工胚乳形成人工種子或直接再生形成完整的植株。由于植物每一個(gè)體細(xì)胞從理論上都存在誘導(dǎo)成胚的可能性，且繁殖速度快、不受地區(qū)、季節(jié)和災(zāi)害性氣候等自然條件的限制；對(duì)于木本植物來說，不必等待漫長(zhǎng)的有性世代，也不必像常規(guī)的無性繁殖那樣需要充足的萌芽插條，一旦獲得優(yōu)良的材料，就可以比常規(guī)繁殖快數(shù)十倍甚至上百倍的速度繁殖優(yōu)良種苗。

作為裸子植物的杉木，體胚的發(fā)生與被子植物的體細(xì)胞胚發(fā)生有著完全不同的途徑和機(jī)理，成熟的種子以及由種子發(fā)育而來的植株，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞十分困難。但在針葉樹種中，雌配子體受精后發(fā)育成種子的過程中有一部分珠心細(xì)胞處于未分化的階段，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，可以利用裂生多胚特性，誘導(dǎo)體胚形成。Gupta等(1985，1995)報(bào)道過利用這一生物學(xué)特性，誘導(dǎo)出花旗松(Pseudotsuga?menziesii)和濕地松(Pinus?elliottii)的體胚，其大致可以分為四個(gè)步驟：胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)(ESM：Embryogenesis?suspensor?mass)的誘導(dǎo)、保持和增殖、體胚的成熟、萌發(fā)和植株再生，并證明該技術(shù)體系具有達(dá)到產(chǎn)業(yè)化的前景。

目前雖有杉木成熟種子萌發(fā)后的下胚軸誘導(dǎo)體胚發(fā)生的報(bào)道，但是只能在外植體上形成個(gè)別體細(xì)胞胚，存在誘導(dǎo)率低、數(shù)量少的問題，難以在生產(chǎn)上應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外尚無利用杉木優(yōu)樹未成熟種子誘導(dǎo)ESM、通過液體增殖ESM、并誘導(dǎo)體胚發(fā)生這一間接體胚發(fā)生途徑并實(shí)現(xiàn)植株再生的成功方法報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是針對(duì)當(dāng)前杉木組織培養(yǎng)器官發(fā)生困難、植株再生率低、難以滿足生產(chǎn)應(yīng)用需要等問題，提供一種利用杉木優(yōu)樹的未成熟胚誘導(dǎo)胚性胚柄團(tuán)形成，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞胚發(fā)生和再生杉木植株的方法，以期實(shí)現(xiàn)能夠快速生產(chǎn)大批高質(zhì)量的苗木，滿足林業(yè)生產(chǎn)對(duì)優(yōu)質(zhì)杉木種苗的需求。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明以杉木優(yōu)樹未成熟胚為起始材料，在適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行多步離體培養(yǎng)，長(zhǎng)期維持未成熟胚ESM的裂生多胚發(fā)生能力，經(jīng)過胚性愈傷誘導(dǎo)、維持、增殖、體胚成熟前期和成熟等階段培養(yǎng)，獲得體胚，再經(jīng)萌發(fā)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)植株的再生。

一種杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生方法，包括以下步驟：

(1)杉木未成熟種子胚的準(zhǔn)備

每年的3月中旬前后，選擇經(jīng)后代測(cè)定表明優(yōu)良的親本，配置雜交組合。并于6月中旬開始，采集杉木雜交組合的球果，在解剖鏡下觀察杉木合子胚的發(fā)育進(jìn)程。取發(fā)育至胚胎選擇、優(yōu)勢(shì)胚、柱狀胚和早期子葉胚階段的杉木球果，迅速置于4℃條件下冷藏保存一周。在無菌條件下，剝?nèi)∏蚬械奈闯墒旆N子胚備用；由于不同杉木生長(zhǎng)的氣候區(qū)不同和年度間氣象條件的變化，以解剖鏡下觀察到的胚胎選擇階段開始到早期子葉胚階段為止均為合適的球果取樣時(shí)間。

(2)ESM的起始誘導(dǎo)