[發(fā)明專利]杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010275858.0
• 申請(qǐng)日: 2010-09-07
• 公開（公告）號(hào): CN101983556A
• 公開（公告）日: 2011-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳金慧;周小紅;施季森
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

1.一種杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)杉木未成熟種子胚的準(zhǔn)備

采集杉木雜交組合的球果，在解剖鏡下觀察杉木合子胚，取發(fā)育至胚胎選擇、優(yōu)勢(shì)胚、柱狀胚和早期子葉胚階段的杉木球果，迅速置于4℃條件下冷藏保存一周。在無(wú)菌條件下，剝?nèi)∏蚬械奈闯墒旆N子胚備用；

(2)ESM的起始誘導(dǎo)

在無(wú)菌條件下，將未成熟種子胚接種至誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿接種8粒種子胚，控溫23℃、暗培養(yǎng)13～18天，誘導(dǎo)獲得ESM；其中，誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基的配方為：DCR為基本培養(yǎng)基，附加2，4-D?2～6mg/L，6-BA?0.5～1.0mg/L，KT?0.5mg/L，Vc?10mg/L，L-Gln?0.45g/L，水解酪蛋白0.5g/L，肌醇0.1g/L，麥芽糖15g/L，Ac?2.5g/L，水晶洋菜2.3g/L；

(3)EMS的維持與增殖

在無(wú)菌條件下，將步驟(2)中誘導(dǎo)獲得的EMS轉(zhuǎn)入維持固體培養(yǎng)基中，控溫23℃，暗培養(yǎng)20天；其中，EMS的維持固體培養(yǎng)基的配方為：DCR基本培養(yǎng)基，2，4-D0.5-2mg/L，6-BA?0.2-0.5mg/L，KT?0.5mg/L，Vc?10mg/L，谷氨酰胺0.45g/L，水解酪蛋白0.5g/L，肌醇0.1g/L，麥芽糖20-25g/L，Ac?2.5g/L，水晶洋菜2.5g/L；

將維持培養(yǎng)20天后的EMS移入液體增殖培養(yǎng)基，控溫23℃，搖床轉(zhuǎn)速為85～90r.p.m，暗培養(yǎng)7天；其中，液體增殖培養(yǎng)基的配方為：DCR基本培養(yǎng)基，2，4-D0.5-2mg/L，6-BA?0.2mg/L，Ac?10mg/L，谷氨酰胺0.45g/L，水解酪蛋白0.5g/L，肌醇2g/L，麥芽糖30g/L；

(4)體胚的成熟前期培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，將步驟(3)中經(jīng)增殖培養(yǎng)的EMS轉(zhuǎn)移到成熟前期液體培養(yǎng)基中，控溫23℃，搖床轉(zhuǎn)速為85r.p.m，暗培養(yǎng)7天；其中，成熟前期液體培養(yǎng)基配方為：DCR基本培養(yǎng)基，ABA?5-10mg/L，GA?0.1～1.0mg/L，Vc?10mg/L，谷氨酰胺0.45g/L，水解酪蛋白0.5g/L，肌醇5g/L，麥芽糖30g/L；

(5)體胚的成熟培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，將步驟(4)中經(jīng)成熟前期培養(yǎng)的材料轉(zhuǎn)移到成熟培養(yǎng)基中，控溫23℃，暗培養(yǎng)30天后，培養(yǎng)出長(zhǎng)為4～5mm的子葉胚；其中，成熟培養(yǎng)基的配方為：DCR基本培養(yǎng)基，ABA?3-8mg/L，GA1-5mg/L，Vc?10mg/L，PEG?8000?100-200g/L，谷氨酰胺0.45g/L，L-Pro?0.2g/L，L-Asp?0.2g/L，水解酪蛋白0.5g/L，肌醇5g/L，麥芽糖30g/L，活性炭2.5g/L，水晶洋菜2.5g/L；

(6)體胚的萌發(fā)

在無(wú)菌條件下，將長(zhǎng)為4～5mm的子葉胚轉(zhuǎn)移至固體DCR基本培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)直至萌發(fā)，即可實(shí)現(xiàn)植株的再生和培育成苗。