[發(fā)明專利]大腸癌特異性抗原肽及大腸癌檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010275415.1
• 申請日: 2010-09-07
• 公開（公告）號: CN101948525A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹廣文;傅傳剛;常文軍;吳玲玲;曹付傲;劉巖;高顯華;李小攀
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/63;C40B50/06;G01N33/574
• 代理公司: 上海德昭知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31204
• 代理人: 繆利明;丁振英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)用檢測試劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種大腸癌特異性抗原肽的表達(dá)載體及構(gòu)建方法、大腸癌特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及操作方法。

背景技術(shù)

大腸癌是常見的惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病率位于第三，在我國則有逐年上升的趨勢，在上海已位居惡性腫瘤發(fā)病率第二位。根據(jù)中國衛(wèi)生部衛(wèi)生信息2007年統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，發(fā)病率占全部惡性腫瘤的第3位，大腸癌死亡率為10.25/10萬，占癌癥致死第5位。大腸癌根據(jù)TNM分期不同可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，各期大腸癌預(yù)后相差很大，早期大腸癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率低，預(yù)后良好，術(shù)后5年生存率可達(dá)97％，進(jìn)展期大腸癌術(shù)后5年生存率僅為40％-50％。因此探索大腸癌早期診斷和篩查方法非常重要。

目前常用的大腸癌檢查方法有直腸指診、糞便隱血實驗、結(jié)腸鏡及影像學(xué)檢查。而這些檢查都存在有不足之處，直腸指診范圍局限，糞隱血實驗敏感性及特異性差，結(jié)腸鏡檢查有一定痛苦，患者較難接受，影像學(xué)檢查對于早期腫瘤不敏感。目前常用的腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原(CEA)，CA19-9等指標(biāo)缺乏敏感性及特異性，不能對大腸癌進(jìn)行早期診斷。因此建立能高通量診斷大腸癌的特異檢查方法是當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容

腫瘤發(fā)生后，腫瘤細(xì)胞表面的特征抗原或腫瘤細(xì)胞分泌的特征抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，這些抗體可存在于尚無癥狀的早期腫瘤患者血清中。通過尋找大腸癌特征抗原，利用它來檢測患者血清中的特異性自身抗體，從而做為分子標(biāo)志，可以早期發(fā)現(xiàn)大腸癌，與現(xiàn)行的其他方法相比，具有微創(chuàng)、簡單、經(jīng)濟(jì)、敏感度及特異度高等特點，方便用于社區(qū)人群的篩查，從而達(dá)到早期檢測大腸癌的目的。

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種大腸癌特異性抗原肽，利用它來檢測患者血清中的特異性自身抗體，從而作為分子標(biāo)志來早期發(fā)現(xiàn)大腸癌。

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種大腸癌特異性抗原肽的表達(dá)載體。

本發(fā)明的第三個目的在于提供該表達(dá)載體的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的第四個目的在于提供包含表達(dá)載體的大腸癌特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，用于檢測早期大腸癌。

本發(fā)明的第五個目的在于提供該試劑盒的制備及其操作方法。

本發(fā)明提供的大腸癌特異性抗原肽，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2、SEQ?IDNo.4、SEQ?ID?No.6、SEQ?ID?No.8，或SEQ?ID?No.10所示。

本發(fā)明提供的大腸癌特異性抗原肽的表達(dá)載體，由噬菌體和編碼大腸癌特異性抗原肽的cDNA片段構(gòu)成，所述cDNA片段的序列如SEQ?ID?No.1、SEQ?IDNo.3、SEQ?ID?No.5、SEQ?ID?No.7或SEQ?ID?No.9所示。優(yōu)選的，所述噬菌體為T7噬菌體。

本發(fā)明提供的大腸癌特異性抗原肽表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括：

a)構(gòu)建大腸癌噬菌體展示肽庫：

抽提30例新鮮大腸癌組織總RNA，等量混合成1mg后抽提mRNA，應(yīng)用oligodT引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA末端進(jìn)行平齊，加Ecol?Ⅰ和Hind?Ⅲ接頭，雙酶切后去除小片斷，然后接入T7噬菌體雙臂，進(jìn)行體外包裝，構(gòu)建大腸癌噬菌體展示肽庫；

b)親和篩選大腸癌特異抗原肽：

取10μl?A/G的瓊脂糖珠置于一1.5ml離心管中，用pH7.4的500μl?PBS洗2次，1％BSA?4℃封閉1h，瓊脂糖珠分別與15μl大腸癌患者及對照患者的血漿4℃孵育過夜，500μl?PBS洗滌3次后，用10μl?PBS溶解富集到的抗體，10管大腸癌的抗體及10管非大腸癌的抗體各自合并成一管，取所述噬菌體展示肽庫擴(kuò)增液20μl，先與20μl的非大腸癌抗體孵育1h，未結(jié)合的上清再與20μl大腸癌抗體結(jié)合，保留結(jié)合到瓊脂糖珠上的噬菌體，并用100μl?1％SDS洗脫，將其轉(zhuǎn)染細(xì)菌至擴(kuò)增，完成一輪親和篩選，重復(fù)上述步驟，反復(fù)進(jìn)行五輪親和篩選；

c)血清學(xué)篩選大腸癌早期檢測分子標(biāo)志：

c1)混合血樣初篩：