[發明專利]大腸癌特異性抗原肽及大腸癌檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201010275415.1
• 申請日: 2010-09-07
• 公開（公告）號: CN101948525A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 曹廣文;傅傳剛;常文軍;吳玲玲;曹付傲;劉巖;高顯華;李小攀
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/63;C40B50/06;G01N33/574
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司 31204
• 代理人: 繆利明;丁振英

1.一種大腸癌特異性抗原肽，其特征在于，所述大腸癌特異性抗原肽的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2、SEQ?ID?No.4、SEQ?ID?No.6、SEQ?ID?No.8，或SEQ?IDNo.10所示。

2.一種權利要求1所述的大腸癌特異性抗原肽的表達載體，其特征在于，由噬菌體和編碼大腸癌特異性抗原肽的cDNA片段構成，所述cDNA片段的序列如SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.3、SEQ?ID?No.5、SEQ?ID?No.7或SEQ?ID?No.9所示。

3.如權利要求2所述的表達載體，其特征在于，所述噬菌體為T7噬菌體。

4.一種大腸癌特異性抗原肽表達載體的構建方法，其特征在于，包括：

a)構建大腸癌噬菌體展示肽庫：

抽提30例新鮮大腸癌組織總RNA，等量混合成1mg后抽提mRNA，應用oligodT引物反轉錄為cDNA，將cDNA末端進行平齊，加Ecol?Ⅰ和Hind?Ⅲ接頭，雙酶切后去除小片斷，然后接入T7噬菌體雙臂，進行體外包裝，構建大腸癌噬菌體展示肽庫；

b)親和篩選大腸癌特異抗原肽：

取10μl?A/G的瓊脂糖珠置于一1.5ml離心管中，用500μl?pH7.4的PBS洗2次，1％BSA?4℃封閉1h，瓊脂糖珠分別與15μl大腸癌患者及對照患者的血漿4℃孵育過夜，500μl?PBS洗滌3次后，用10μl?PBS溶解富集到的抗體，10管大腸癌的抗體及10管非大腸癌的抗體各自合并成一管，取所述噬菌體展示肽庫擴增液20μl，先與20μl的非大腸癌抗體孵育1h，未結合的上清再與20μl大腸癌抗體結合，保留結合到瓊脂糖珠上的噬菌體，并用100μl?1％SDS洗脫，將其轉染細菌至擴增，完成一輪親和篩選，重復上述步驟，反復進行五輪親和篩選；

c)血清學篩選大腸癌早期檢測分子標志：

c1)混合血樣初篩：

篩選后得到的噬菌體展示肽庫用LB液體培養基1∶10⁸稀釋后，取100μl噬菌體液、250μl新搖好的BLT5403細菌，3ml保溫55℃的頂層瓊脂，混勻后立刻倒入鋪有LB的平皿中，冷卻后，37℃溫箱孵育4小時，可見有單個的噬菌斑形成，每1個1.5ml離心管中，加入1ml新搖好的細菌BLT5403，隨機挑取單個的、邊界清晰的噬菌體克隆于1個1.5ml離心管中，共隨機挑選噬菌體克隆2000個，并按順序編號，挑好的噬菌體置37℃恒溫振蕩器搖4小時以上，直至每一管液體均變澄清為止，挑選好的噬菌體克隆置4℃保存，用T7引物進行PCR反應，擴增所挑選噬菌體克隆的插入片段，挑取擴增片段200bp以上的噬菌體克隆進行ELISA實驗進一步篩選；

所述ELISA實驗的步驟為：

將T7TAILER抗體用pH7.4的PBS按1∶1000來稀釋，每孔取100μl包被于96孔酶標板，4℃搖床輕搖過夜；

用洗液洗板，每孔300μl，洗四次，每次約1分鐘，拍干；采用200μl?2％BSA/PBS于26℃封閉2小時；

用洗液洗板，每孔300μl，洗四次，每次約1分鐘，拍干；加入用1％BSA以1∶5比例稀釋的噬菌體100μl，每個標本加4孔；每次試驗均加入沒有插入片段的空噬菌體作為陰性對照4孔和空白對照2孔，室溫孵育2小時，棄去孔內液體，拍干；

每個噬菌體標本加入100μl?1％BSA以1∶500比例稀釋的大腸癌組混合血漿、對照組混合血漿各2孔，所用大腸癌組、對照組的混合血漿的患者信息同步驟b)親和篩選所用的患者，室溫孵育1小時；

洗板后每孔加入100μl?1∶10000稀釋的HRP耦聯的山羊抗人IgG，于26℃室溫孵育1小時；

洗板后每孔加入溫度平衡至室溫的顯色劑A、B各2滴，混勻后，37℃孵育5分鐘，加入終止液25μl，立刻用酶標儀檢測，取波長450nm，先用空白孔調零，然后讀取各孔的OD值，并記錄結果，每次進行ELISA按下列公式計算并判斷結果：樣品平均OD值/陰性對照平均OD值，比值≥2.0，判斷為陽性結果；樣品平均OD值/陰性對照平均OD值，比值＜2.0，判斷為陰性結果；找出與大腸癌混合血清反應為陽性，而與對照混合血清反應為陰性的有意義的噬菌體克隆；

c2)獨立血清復篩：

將經步驟c1)初篩后的所述有意義的噬菌體克隆應用30例大腸癌患者血清及30例健康對照血清進行ELISA復篩，步驟同c1中所述ELISA實驗的步驟，不同之處在于篩選所用的血清為獨立的，而不是混合血清，對比所述有意義的噬菌體克隆與各大腸癌患者血清及對照血清的反應性，應用獨立樣本t檢驗的方法，挑選出與30例大腸癌血清及30例健康對照血清的反應數據具有顯著差異的噬菌體肽克隆；

c3)大腸癌特異性抗原肽重組載體的診斷模塊的獲得：

應用dige?R軟件采用隨機森林法對所有獨立血清樣本進行2000次隨機抽樣，根據各噬菌體區分大腸癌血清的能力，對步驟c2所得到的具有顯著差異的噬菌體的篩選能力從高到低進行排序；采用貝葉斯雙變量模型，依次檢驗噬菌體聯合檢測的效果，按聯合數量最少、且聯合檢測的靈敏度與特異性與步驟c2所得到的具有顯著差異的噬菌體聯合檢測的靈敏度與特異性最接近的標準，得到5個大腸癌特異性抗原肽的表達載體，其上插入的cDNA片段的序列如SEQ?ID?No.1、SEQ?IDNo.3、SEQ?ID?No.5、SEQ?ID?No.7、SEQ?ID?No.9所示。