[發明專利]楊桃細菌性斑點病原細菌分子檢測引物及其檢測方法

無效

• 申請號: 201010275167.0
• 申請日: 2010-09-08
• 公開（公告）號: CN101935708A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 陳慶河;翁啟勇;林靜;李本金;蘭成忠
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及一種楊桃細菌性斑點病原細菌分子檢測引物及其檢測方法，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術的領域。

背景技術

楊桃細菌性斑點病是由楊桃細菌性斑點病原細菌（Pseudomonas?syringae?pv.?averrhoi）侵染引起的一種病害。楊桃(Carambola)系酢漿草科，屬于熱帶、亞熱帶常綠喬木果樹。在我國廣東、海南等省普遍栽種。近年，在廣東、海南兩省一些楊桃種植園或苗圃發現一種導致嚴重落葉的葉斑病，切取葉片病斑組織作顯微鏡檢查，發現有細菌溢流，認為是一種細菌性病害，該病害在國內外尚未見報道，因此，有必要對該病害進行研究，為防治該病提供理論依據（文衍堂，黃智輝，1995）。在臺灣，本病害于1997年11月在苗栗縣卓蘭鎮首次被發現，經過全臺灣主要楊桃產區調查結果，目前僅在栗縣卓蘭鎮、臺中縣東勢鎮、石岡鄉、新社鄉、南投縣國姓鄉及彰化縣員林鎮等地發生。

楊桃細菌性斑點病全年發生，可感染葉片、枝條以及果實，但以葉片最為嚴重。葉片患病時，初期產生暗綠色水浸狀斑點。以后擴大為紫紅色的斑點，病斑周圍有明顯的黃色暈環，嚴重時葉片黃化并提前落葉。枝條患病時，呈暗褐色壞疽斑點。果實患病時，初期產生紫褐色大小不一的壞疽病斑，病斑周圍有黃色暈環，嚴重時果實畸形。該病的傳染途徑：患病的葉片、枝條以及果實為主要感染源，病原菌可借由雨水飛濺傳播，并經由氣孔以及傷口侵入感染，因此，春雨、梅雨以及臺風季節本病發生較為嚴重。

自從發現楊桃細菌性斑點病原細菌以來，臺灣的研究人員便對其檢測技術進行研究。此病害可根據發病病癥、病原菌的生理生化特性以及回接試驗來判定，但此傳統方法耗時且費力。近年來隨著分子生物技術的進步，聚合酶鏈式反應（polymerase?chain?reaction，PCR）常被應用于動植物病害的診斷，以及病原菌的鑒定與偵測，臺灣宋氏與徐氏（2002）已發展PCR技術應用于此病害的診斷鑒定。

植物病原生物的分子檢測技術（以PCR技術為平臺）是當前該領域的發展方向，許多重要病原生物都已經建立了分子檢測技術，越來越多的分子檢測試劑盒已經或正在被研制。我國雖然在植物病原生物分子檢測技術方面起步較晚，但目前也研制出了許多用于植物病原生物檢測的技術，尤其是一些擁有自主知識產權的檢測方法，并將之投入到商業生產和應用中。但在楊桃細菌性斑點病檢測方面國內至今還未見有分子檢測技術的系統研究，更沒有相關檢測試劑盒的研制和推廣。

發明內容：

本發明是針對現有技術中楊桃細菌性斑點病菌的生物學檢測方法所需周期長、目前楊桃細菌性斑點病菌分子檢測方法特異性差，靈敏度低的問題，提供了一種楊桃細菌性斑點病菌的特異分子檢測引物以及結果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高的楊桃細菌性斑點病菌的快速分子檢測診斷的方法。

實現本發明的目的包括下列步驟：

1．根據楊桃細菌性斑點病菌ITS基因序列的特異性，設計了對楊桃細菌性斑點病菌具有特異擴增作用的一對PCR引物，即特異分子檢測引物的序列為：

上游引物　PSaveF:?5'----CTTATCGACGACTCAGCTGCG----3'

下游引物　PSaveR:?5'----TCATGCGTTGATCGTCAGGATC----3'。

2．?楊桃細菌性斑點病菌特異分子檢測體系的建立

（1）采用酚、氯仿法,從植物組織的葉片或果實中提取DNA；

（2）PCR擴增：以提取的DNA為模板進行PCR擴增；PCR反應體系25ul，包括2.5ul?10×PCR反應緩沖液，25mM?Mg^2+?2ul，2.5mM?dNTPs?2ul,?0.5U?Taq?DNA聚合酶，10uM引物PSaveF?/?PSaveR各0.4ul和10ng模板DNA,?d.d.H₂O補足25ul。PCR反應條件為:?95℃?預變性3min；?94℃變性?1min,?60℃退火?30?sec?,72℃延伸45?sec?共30個循環；72?℃延伸10?min。

（3）然后取PCR產物用瓊脂糖電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下根據擴增產物的大小判定結果；所述瓊脂糖電泳分離采用1.5%瓊脂糖電泳。

（4）如果能特異性地擴增出373bp產物時，即可判斷所述的植株組織樣品中存在楊桃細菌性斑點病菌；否則所述的植株組織樣品中未存在楊桃細菌性斑點病菌。