[發明專利]真菌(1-3)-β-D葡聚糖比色檢測試劑盒的制備及其使用方法

無效

• 申請號: 201010275163.2
• 申請日: 2010-09-08
• 公開（公告）號: CN102305787A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發明（設計）人: 苑慶華
• 申請（專利權）人: 天津市一瑞生物工程有限公司
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;C12Q1/56
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

所屬領域：?

生物醫藥范疇，更確切說是應用人工合成顯色基質，利用真菌細胞壁成分(1-3)-β-D葡聚糖激活東方鱟血細胞裂解物中G因子，從而水解合成顯色基質Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)進而發生縮合反應而定量檢測(1-3)-β-D葡聚糖方法及相關應用于臨床診斷深部真菌感染的產品。?

背景技術：

經初步檢索，未查到以人工合成顯色基質Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)制備成比色檢測真菌細胞壁成分(1-3)-β-D葡聚糖試劑專利。?

發明內容：

本發明是以人工合成顯色基質Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)利用微量(1-3)-β-D葡聚糖特異性地激活東方鱟血細胞裂解物中含有的G因子、凝固酶原及凝固蛋白原，從而誘發東方鱟血細胞裂解物凝固化反應。被激活的凝固酶水解合成顯色基質釋放出顯色基團DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)，DIAN與1-萘酚-4-磺酸鈉、(1-萘酚-2-磺酸鈉或1-萘酚-5-磺酸鈉)在高碘酸鈉存在下生成藍色縮合物，在630-680nm波長處，酶原激活量與形成的縮合物的吸收度在一定范圍內呈線形關系，從而定量檢測出樣品中(1-3)-β-D葡聚糖濃度。該試劑盒可以用來早期診斷臨床深部真菌感染。參照說明書附圖將本發明內敘述如下：?

一、合成顯色基質?

采用生物技術人工合成Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)類顯色基質。具體合成工藝(見工藝路線圖)。?

二、東方鱟血細胞裂解物提取、分離?

2.1血細胞裂解液配制：其中裂解液中成分應含有Na⁺，Mg²⁺，Ca²⁺等金屬離子，調節pH后并進行121℃90分鐘滅菌處理后方可使用。?

2.2血細胞裂解：無菌操作，取約20g血細胞，按照1-5比例加入血細胞裂解液，并用高速均漿機進行200000rpm/min，5-10分鐘破損細胞，將破損后的組織細胞液放入-30℃冰箱內快速冷凍保存10小時，之后將冷凍細胞液取出，在室溫下緩慢溶解，待全部溶解后，再用高速組織均漿機進行200000rpm/min，5-10分鐘破損細胞，然后將破損后的組織細胞液再次放入-30℃冰箱內快速冷凍保存10小時，重復上次過程2遍即可。?

2.3血細胞分離、提取：將上述血細胞裂解液取出后進行3000rpm/min，5-8分鐘離心，取上清液，按照1-2比例加入氯仿，劇烈震蕩10分鐘，然后轉移至無熱原離心沉淀管中在4℃下進行10000rpm/min，5-10分鐘分離，仔細取出上清液備用。?

三、顯色合成基質及縮合溶液的配制及處理?

1、顯色合成基質溶液配制?

將顯色合成基質用滅菌注射用水溶解，配制成6mM濃度，使用0.22um濾膜過濾，4℃保存備用。?

2、顯色液A?

為6mM的1-萘酚-4-磺酸鈉溶液(使用pH?8.5濃度為0.05mol的硼酸緩沖液配制)。?

3、顯色液B?

為2％高碘酸鈉溶液(使用注射用水配制)。?

4、顯色液A及顯色液B處理?

將上述顯色液A及顯色液B配制后，分裝至西林瓶或安瓿瓶中然后進行冷凍干燥。?

5、顯色合成基質溶液處理?

將顯色合成基質溶液，分裝至西林瓶或安瓿瓶中然后進行冷凍干燥。?

四、反應主劑的制備與標定?

1、取提取、分離好的東方鱟血細胞的上清液，加到含有1.0M氯化鎂0.5M氯化鈣溶液中，分裝至西林瓶或安瓿瓶中進行冷凍干燥即為反應主劑。?

2、取上述冷凍干燥好的反應主劑，按照標示值加入溶解液使其完全溶解，然后用滅菌注射用水1-10倍稀釋，用紫外分光光度計檢測，應在270±3nm處有吸收峰。?

3、將(1-3)-β-D葡聚糖標準品用溶解液溶解并稀釋成最終濃度為100pg/ml溶液，與反應主劑反應，應出現反S型檢測峰。?

五、(1-3)-β-D葡聚糖比色檢測試劑盒的性能?