[發明專利]甜(辣)椒未成熟小孢子直接誘導萌發成植株的方法

有效

• 申請號: 201010274159.4
• 申請日: 2010-09-07
• 公開（公告）號: CN101946713A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 李春玲;鄧曉梅;朱至清;佟曦然
• 申請（專利權）人: 北京市海淀區植物組織培養技術實驗室
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京國浩君伍知識產權代理事務所(普通合伙) 11346
• 代理人: 朱登河

技術領域

本發明屬于植物細胞工程技術領域，具體涉及一種甜(辣)椒未成熟小孢子直接誘導萌發成植株的方法。

背景技術

甜(辣)椒(Capsicum?annuum?L.)屬茄科一年生草本植物，我國栽培面積最大的蔬菜作物之一。辣椒的雜種優勢非常明顯，為了提高辣椒的質量和產量，辣椒的育種工作對生產起著重要的作用。但傳統的育種方式存在周期長、效率低等問題。通過花藥或花粉培養獲得大量單倍體植株，從而獲得純合二倍體植株，不僅大大加快了育種速度，而且顯著地提高了選擇效果，節省了大量的人力物力。花粉培養(游離小孢子培養)則更優于花藥培養，花粉培養排除了藥壁組織二倍體體細胞的干擾，獲得的植株完全是由單倍體單細胞發育而來，同時也避免了嵌合體的發生，在通過自發或人工誘導染色體加倍后，能獲得遺傳上完全純合的雙單倍體(DH)。這種遺傳穩定的材料，可用于雜交育種及種質資源的豐富和改良。

自從20世紀70年代煙草和曼陀羅小孢子培養成功獲得單倍體植株以來的三十多年里，大白菜、油菜、大麥、小麥、水稻等作物的小孢子培養都獲得了成功。油菜等作物的規模化雙單倍體(DH)植株生產技術在育種上得到了很好的應用。但目前國內外對于甜(辣)椒游離小孢子培養獲得植株的成功報道并不多見。Gonza′lez-Melendi等1996年，Regner?1996年，Mityko′和Fa′ri?1996年和1997年，Ba′ra′ny等2001年都報道了由辣椒游離小孢子獲得胚狀體的研究，并沒有得到再生植株。U.Bal等在2003年，L..Biotechnology?&?Biotechnological?Equipment，17(2)：38-43頁曾報道用甘露醇饑餓、10℃預處理、無激素并添加17％蔗糖的NLN培養基得到了小孢子愈傷組織；直到2006年，Supena等在Plant?Cell?Reports，(25)1：1-10頁報道了選用了10個印度尼西亞辣椒品種，用9℃低溫、含有2％麥芽糖的雙層Nitsch培養基培養辣椒花藥，收集散落的小孢子，其中6個品種得到了胚狀體并獲得單倍體植株。但是最高頻率平均10個花蕾只獲得了1個正常植株；劉凡等在2007年，分子生物學報40(6)：371-379頁報道從預培養15天的辣椒花藥中機械游離小孢子細胞團，只獲得了發育程度不同的各類胚狀體；Kim等在2008年，.Plant?Cell?Reports，27：425-434頁上報道用熱激、蔗糖饑餓以及含有9％蔗糖的NLNS培養基等方法培養辣椒游離小孢子，建立了較高的胚狀體發生率及完整的植株再生體系，共獲得了55個胚狀體，平均一皿(約含10X10⁴個花粉)獲得5.5個胚狀體，但實驗只在辣椒的一個品種上獲得成功。從上述報道可知，不同辣椒品種的游離小孢子培養方法差異非常大，從而說明了甜(辣)椒品種間基因型的差異對于小孢子培養有著的重要影響。而且游離小孢子培養成功獲得再生植株的僅限于辣椒的幾個品種。

發明內容

為了克服現有技術的上述缺陷，本發明提供一種甜(辣)椒未成熟小孢子經誘導直接萌發成植株的培養方法。

本發明的技術方案如下：

甜(辣)椒未成熟小孢子直接誘導萌發成植株的方法，包括下述步驟：

(1)、無菌花藥的獲得：對小孢子處于單核靠邊期或雙核期的花蕾進行表面消毒，剝離花藥；花蕾的選擇方法是通過觀察花蕾外部形態，挑選萼片和花瓣等長或花瓣稍長于萼片，并且內部花藥尖端至1/3或1/2處微紫的花蕾；

(2)、無菌花藥的預培養：將步驟(1)中的無菌花藥置于改良固體R培養基中，4℃低溫處理2～15天；對無菌花藥進行低溫預處理的目的在于：一方面有利于保持小孢子活力，另一方面由于花藥已在固體培養基上培養了數天，在收集小孢子時，很容易挑選出狀態好且沒有污染的花藥用于小孢子收集，從而保證了花藥的質量；

(3)、小孢子的收集：取步驟(2)中預培養后的花藥，置于改良液體R培養基中，擠壓使小孢子游離，300目濾網過濾，離心收集小孢子；

(4)、小孢子的誘導培養：將步驟(3)獲得的小孢子置于含蔗糖或麥芽糖3～15％、2，4-D濃度為0.1～0.5mg/L，KT濃度為0.5～1mg/L的液體R培養基中，在24～28℃下，黑暗或光照培養；

(5)、植株的獲得：當步驟(4)中的小孢子經誘導形成胚狀體后，分別按照下述(i)、(ii)、(iii)三種不同路徑進行培養，得到正常植株；

(i)小孢子經誘導后形成的胚狀體為魚雷型或子葉型胚時，轉至1/2MS培養基或含有濃度為1～3％蔗糖的1/2MS培養基中培養，得到正常植株；