[發(fā)明專利]一種羊水來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010273878.4
• 申請日: 2010-09-07
• 公開（公告）號: CN101948798A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃荷鳳;徐晨明;陳松長;黃祎婷;王金福;胡文勝
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種羊水來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化方法，具體涉及一種源于產(chǎn)前診斷羊水培養(yǎng)物廢棄上清的羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化方法。

(二)背景技術(shù)

羊水間充質(zhì)干細(xì)胞(Human?amniotic?fluid-derived?mesenchymal?stemcells，人羊水干細(xì)胞)是一類胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞，除具有成體干細(xì)胞無致瘤性、相對容易培養(yǎng)等優(yōu)點外，還具有以下一些特點：1、來源豐富，容易獲取；2、增殖能力和分化能力遠(yuǎn)強于骨髓來源的成體干細(xì)胞，在分化能力上更接近于胚胎干細(xì)胞。3、低免疫原性、具有可應(yīng)用于母嬰相關(guān)疾病的研究和先天性疾病的治療的特殊應(yīng)用前景。自從In’t?Anker等從孕中期(17～22周)羊水中分離培養(yǎng)出胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞以來，人羊水干細(xì)胞成為干細(xì)胞研究的新熱點，在胎兒組織工程、細(xì)胞治療、藥物篩選等研究領(lǐng)域展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。

羊水培養(yǎng)細(xì)胞是多種類型的混合物，包含了3類形態(tài)和生長特點的不同的細(xì)胞：上皮樣-E型細(xì)胞、羊水特有-AF型細(xì)胞、成纖維樣-F型細(xì)胞。羊水細(xì)胞通常的貼壁時間為5～7天，最早貼壁的是上皮樣-E型細(xì)胞和羊水特有-AF型細(xì)胞，而來自間充質(zhì)組織的、被認(rèn)為是人羊水干細(xì)胞來源的F型細(xì)胞卻通常出現(xiàn)在培養(yǎng)的后期。產(chǎn)前診斷多在羊水培養(yǎng)的第5～6天收集貼壁細(xì)胞進(jìn)行核型分析，羊水培養(yǎng)物上清液及存留的尚未貼壁的有活力的細(xì)胞則一并予以廢棄。

傳統(tǒng)的人羊水干細(xì)胞分離純化需要經(jīng)過羊水穿刺、細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，后續(xù)進(jìn)行流式細(xì)胞或免疫磁珠分選等步驟，操作復(fù)雜，成本昂貴。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是探索產(chǎn)前診斷羊水培養(yǎng)物體廢棄上清中胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、純化和擴增條件，不干擾產(chǎn)前診斷的程序，也無需額外的穿刺羊水，為節(jié)儉高效地進(jìn)行胎兒組織工程種子細(xì)胞庫的建立和干細(xì)胞的臨床治療奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明采用技術(shù)方案是：

一種羊水來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化方法，所述方法包括如下順序步驟：

(1)取產(chǎn)前診斷羊水培養(yǎng)物的廢棄上清(即進(jìn)行產(chǎn)前診斷時羊水培養(yǎng)物收集貼壁細(xì)胞后的剩余上清)，以500～1000cell/cm²密度種植到培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)至出現(xiàn)梭形類成纖維細(xì)胞樣的間充質(zhì)干細(xì)胞集落，去除非貼壁細(xì)胞，加入細(xì)胞培養(yǎng)液I繼續(xù)培養(yǎng)4～7天，每2～3天換新鮮培養(yǎng)液；所述細(xì)胞培養(yǎng)基I終濃度組成如下：

15％FBS+4～8ng/ml?bFGF+100U/ml青霉素+100U/ml鏈霉素，溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)液；

(2)取步驟(1)培養(yǎng)獲得的細(xì)胞以5～10cell/cm²密度種植于培養(yǎng)皿上，加入細(xì)胞培養(yǎng)液II培養(yǎng)直至單克隆細(xì)胞長出(約7～12天)，即得所述羊水來源的間充質(zhì)干細(xì)胞；所述細(xì)胞培養(yǎng)液II終濃度組成如下：20％FBS+4～8ng/ml?bFGF+100U/ml青霉素+100U/ml鏈霉素，溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)液。

具體的，所述廢棄上清由如下方法獲得：取用于產(chǎn)前診斷的中期(17～22周)無菌羊水樣本，1500rpm離心10min，取上清(一般1～2mL即可)加等體積細(xì)胞培養(yǎng)液II，重懸細(xì)胞沉淀，移至T₂₅培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)7天后，收獲貼壁細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷，收集廢棄上清備用；所述細(xì)胞培養(yǎng)液II終濃度組成如下：20％(v/v)FBS+4～8ng/ml?bFGF+100U/ml青霉素+100U/ml鏈霉素，溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)液。

所述細(xì)胞經(jīng)過特定培養(yǎng)基下經(jīng)過極低密度種植而成的成纖維樣細(xì)胞，具有多向分化能力，與成體細(xì)胞相比還具有良好的擴增能力，可傳代至15代以上而保持原來的特性。

所述羊水來源的間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定：1)細(xì)胞形態(tài)觀察，經(jīng)過極低密度種植，單克隆細(xì)胞篩選后成纖維樣細(xì)胞比例大于95％；2)細(xì)胞增值能力，P5、P8代細(xì)胞的群體倍增時間分別為28h、29.8h；3)細(xì)胞表型鑒定，全能干細(xì)胞特異表型陽性(OCT-4，SSEA-4)間充質(zhì)表型陽性(CD29，CD105)，造血系表型陰性(CD34)，間充質(zhì)干細(xì)胞占到95％以上；4)免疫原性檢測，HLA-II抗原陰性(HLA-DR流式檢測結(jié)果為0.6％)；5)多向分化能力，具有成骨和成脂分化能力；6)無致瘤性。