[發明專利]一種根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法

有效

• 申請號: 201010273537.7
• 申請日: 2010-09-07
• 公開（公告）號: CN101942035A
• 公開（公告）日: 2011-01-12
• 發明（設計）人: 鄭春陽;魏國祥;張巍
• 申請（專利權）人: 天津強微特生物科技有限公司
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;C12P19/04;C12R1/41
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技術領域

本發明涉及一種從根瘤菌發酵液中提取及精制根瘤菌胞外多糖的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

微生物多糖是細菌、真菌和藍藻等微生物在代謝過程中產生的對微生物有保護作用的生物高聚物，根據在細胞內不同的存在形式，通常被分為三類：①構成微生物細胞成分的胞內多糖；②黏附在細胞表面上的胞壁多糖；③分泌到培養基中的胞外多糖，包括微莢膜、莢膜、黏液層和菌膠團。微生物多糖具有廣泛的應用價值，如在工業生產與生活的許多領域中作為微生物絮凝劑、微生物采油中的生物化學調剖劑、食品添加劑、保鮮劑、抗癌醫藥品、包裝材料等。

根瘤菌胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)是對宿主植物特異性起決定性作用的一類重要物質，也是根瘤菌與宿主植物之間進行細胞識別的信息分子，具有免疫調節、抗腫瘤及其他一些功能。例如，來自特殊太陽花根瘤菌分泌的胞外多糖，已經開發成為一種名為根瘤菌膠的產品，該產品具有優異的鎖水和水分平衡能力，且粘度隨溫度差的突變特性而會產生超凡的膚感，以及還會有舒緩皮膚，減輕紅血絲，抗炎及產生皮膚的清涼感，從而作為一種化妝品原料廣泛地被用于化妝品行業。

根瘤菌胞外多糖作為一種新型的糖資源，已經引起人們的關注。但根瘤菌胞外多糖的提取和精制方法卻鮮有報道，國內只有山西大學韓勇等人(根瘤菌N613胞外多糖發酵條件及抗腫瘤作用研究，微生物學通報，2007年34(5)，909～913)研究了根瘤菌Rhizobium?sp.N613胞外多糖的提取方法，經過加水稀釋、離心去除菌體、真空濃縮、乙醇沉淀、Sevage法除蛋白、乙醇再次沉淀、真空干燥等步驟。此方法具有步驟多、提取成本高、且成品含有中性和堿性多糖缺點。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的是提供一種從根瘤菌發酵液中提取和精制根瘤菌胞外多糖的方法。此方法通過對提取和精制工藝的改良，獲得高純度根瘤菌胞外多糖，并且節省了成本。

本發明是通過下述步驟完成：

1)稀釋預處理

在發酵液中加入1～10倍體積的蒸餾水，采用稀堿調溶液pH至8～10，開啟攪拌并加熱至60～80℃，并持續0.2～5小時；

2)絮凝除蛋白

在經稀釋預處理的根瘤菌發酵液中加入絮凝劑，然后用稀酸調整溶液pH至4～6，攪拌，當有大塊絮狀物出現時停止，采用10000g離心30～120min，收集上清液；

3)離子交換

上清液采用0.5～2BV速度上陰離子交換劑(Cl^-型)柱，采用酚-硫酸法檢測多糖，漏吸停止上柱，采用蒸餾水沖洗至無色為止，采用2mol/L濃度的NaCl溶液洗脫，然后收集多糖洗脫峰；

4)濃縮除鹽

收集的含多糖離子交換液，采取1000～100000Da分子量的超濾膜，控制過濾壓力0.3～2.8Mpa，濃縮至多糖質量濃度至15～40％時停止；

5)酒精醇沉

在多糖濃縮液中，緩慢加入2～4倍體積質量濃度≥95％的酒精，并采用稀酸調至pH4～7，然后降溫至-20～4℃，放置4～24小時醇沉，然后采用10000g離心30min，收集多糖沉淀物；

6)真空干燥

多糖沉淀置于40～70℃真空干燥箱內，控制相對真空度≥0.085Mpa，進行干燥，獲得成品。

所述多糖是由植物、海澡或微生物所產生的酸性多糖。

所述多糖優選自微生物產生的酸性多糖。

所述絮凝除蛋白步驟中，所述絮凝劑為食品級，選自聚丙烯酸、聚丙烯酸鈉、殼聚糖、聚丙烯酰銨中的任意一種。

所述絮凝除蛋白步驟中，菌體分離方法采用離心分離或板框分離。

所述離子交換步驟中，所述陰離子交換劑采用DEAE-纖維素、DEAE-Sepharose、強或弱堿性陰離子交換聚丙乙烯系列樹脂。

所述離子交換步驟中，所述陰離子交換劑優選為DEAE-纖維素。

所述在真空干燥步驟中，所述干燥的方式為真空干燥、噴霧干燥、滾筒干燥或流化床干燥方式。

而且在絮凝除蛋白步驟中，沉淀可根據殘留多糖含量采取數次菌體洗滌，然后再合并過濾液。在酒精醇沉步驟中，所得多糖沉淀還可用酒精進行多次洗滌，以去除雜質和色素。

最后得到的多糖產品可作為一種提高免疫功能有效成份用于食品、保健品、化妝品或藥品。