[發(fā)明專利]高通量水稻轉(zhuǎn)基因方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010273112.6
• 申請日: 2010-09-06
• 公開（公告）號(hào): CN101979506A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 安成才;黃萍;張旭;付力文;楊麗;張起濤;孔雙蕾;任姣;孔寅飛;高音;于祥春
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/04
• 分類號(hào): C12N5/04;C12N15/82;A01H5/00;A01H5/10
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及高通量水稻轉(zhuǎn)基因方法。

背景技術(shù)

水稻是世界上最主要的糧食作物之一。傳統(tǒng)的雜交育種技術(shù)為水稻品種改良作出了重要貢獻(xiàn)，然而雜交育種技術(shù)難以打破物種的局限性，極大地限制了跨越物種的育種要求。隨著DNA重組技術(shù)及植物遺傳工程技術(shù)的發(fā)展，使得跨越物種間的分子育種成為可能。通過基因工程手段將目的基因轉(zhuǎn)移到受體植物的基因組中，使外源基因在異源受體植物中穩(wěn)定遺傳，并賦予植物新的農(nóng)藝性狀(包括抗蟲、抗病、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等)，已成為提高產(chǎn)量、改良品質(zhì)等培育新品種、新品系的重要有效途徑。

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、PEG法、花粉管通道法等多種方法。目前水稻常用的轉(zhuǎn)基因方法以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為主，基因槍轟擊法次之。這兩種方法都以種子愈傷組織為轉(zhuǎn)基因受體，通過農(nóng)桿菌浸染或基因槍轟擊，依靠轉(zhuǎn)化細(xì)胞的脫分化和再分化這一組織培養(yǎng)的植株再生過程，實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移，獲得轉(zhuǎn)基因植株。但是該方法受植物種類、基因型、外植體再生能力、農(nóng)桿菌的活力、嚴(yán)格的無菌環(huán)境、分化再生條件、人工氣候室等諸多因素的影響，并存在著實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差、遺傳轉(zhuǎn)化成本高，工作量大、周期長，以及在組織培養(yǎng)過程中可能導(dǎo)致體細(xì)胞變異、轉(zhuǎn)基因植株的育性降低甚至喪失等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于基因轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，溶劑是水，溶質(zhì)包括5-10g/L的蔗糖、100-300μL/L?Silwet?L-77、1-5μg/L的赤霉素和0.1-0.5mg/L的細(xì)胞分裂素。

進(jìn)一步，上述培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加Silvet?L-77、赤霉素、細(xì)胞分裂素得到的培養(yǎng)基；其中Silvet?L-77、赤霉素和細(xì)胞分裂素在培養(yǎng)基的終濃度分別為100-300μL/L、1-5μg/L和0.1-0.5mg/L；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水，溶質(zhì)如表1所示。

表1、MS基本培養(yǎng)液的溶質(zhì)

上述Silwet?L-77的優(yōu)選濃度是200μL/L；所述赤霉素的優(yōu)選濃度是3μg/L；所述細(xì)胞分裂素的優(yōu)選濃度是0.1mg/L。

上述赤霉素是GA3；上述細(xì)胞分裂素是激動(dòng)素KT。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種水稻轉(zhuǎn)基因方法。

本發(fā)明提供的水稻轉(zhuǎn)基因方法包括如下步驟：將含有待轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液浸漬或淋沖水稻花序，成熟后收獲種子；

所述含有待轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液是將含有待轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌懸浮于上述的培養(yǎng)基中得到的轉(zhuǎn)化液；所述含有待轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液的OD₆₀₀為1.0-1.2。

具體地講，OD₆₀₀為1.0-1.2是將上述含有待轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌以1∶100接菌于LB液體培養(yǎng)基(含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平)中，28℃、230rpm/h懸浮培養(yǎng)16h，再以1∶100轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)液、同樣條件培養(yǎng)12小時(shí)(至OD₆₀₀在1.5-2.0)。經(jīng)離心收集菌體后，加入等體積的上述培養(yǎng)基重懸至所述OD₆₀₀為1.0-1.2。

上述含有待轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌是將含待轉(zhuǎn)基因的重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中得到的；所述含待轉(zhuǎn)基因的重組載體是將目的基因插入pCAMBIA1381或pJim19質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)間得到的重組表達(dá)載體。

上述水稻花序?yàn)樵诔趸ㄆ诮?jīng)人工授粉后的花序；所述浸漬或淋沖是在自所述人工授粉時(shí)起的3小時(shí)內(nèi)進(jìn)行的。

上述浸漬或淋沖的時(shí)間為20-40秒，優(yōu)選是30秒。

進(jìn)一步，上述方法還包括在所述收獲種子步驟之后進(jìn)行種子萌發(fā)，得到轉(zhuǎn)基因水稻。

上述方法優(yōu)選還包括在所述種子萌發(fā)后的篩選，所述篩選包括如下步驟：在所述收獲種子后，將種子在含有潮霉素的抗性培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選；所述潮霉素在所述抗性培養(yǎng)基中的濃度為40-60mg/L，優(yōu)選是50mg/L；所述抗性篩選時(shí)間為20-30天。

上述篩選還包括所述抗性篩選后的分子生物學(xué)檢測，優(yōu)選是PCR檢測、Southern?blot檢測和/或Western?blot檢測；所述PCR檢測的引物是檢測潮霉素抗性標(biāo)記基因的引物和/或檢測目的基因的引物。