[發(fā)明專利]高通量水稻轉(zhuǎn)基因方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010273112.6
• 申請日: 2010-09-06
• 公開（公告）號: CN101979506A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 安成才;黃萍;張旭;付力文;楊麗;張起濤;孔雙蕾;任姣;孔寅飛;高音;于祥春
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82;A01H5/00;A01H5/10
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

1.一種用于基因轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基，其特征在于：所述培養(yǎng)基的溶劑是水，溶質(zhì)包括5-10g/L的蔗糖、100-300μL/L?Silwet?L-77、1-5μg/L的赤霉素和0.1-0.5mg/L的細(xì)胞分裂素。

2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于：所述培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加Silvet?L-77、赤霉素、細(xì)胞分裂素得到的培養(yǎng)基；其中Silvet?L-77、赤霉素和細(xì)胞分裂素在培養(yǎng)基的終濃度分別為100-300μL/L、1-5μg/L和0.1-0.5mg/L；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水，溶質(zhì)如表1所示。

3.如權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于：所述Silwet?L-77的濃度是200μL/L；所述赤霉素的濃度是3μg/L；所述細(xì)胞分裂素的濃度是0.1mg/L。

4.如權(quán)利要求1-3中任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于：所述赤霉素是GA3；所述細(xì)胞分裂素是激動素KT。

5.一種水稻轉(zhuǎn)基因方法，包括如下步驟：將含有待轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液浸漬或淋沖水稻花序，成熟后收獲種子；

所述含有待轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液是將含有待轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌懸浮于權(quán)利要求1-4中任一所述的培養(yǎng)基中得到的轉(zhuǎn)化液；所述含有待轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液的OD₆₀₀為1.0-1.2。

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述含有待轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌是將含待轉(zhuǎn)基因的重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中得到的；所述含待轉(zhuǎn)基因的重組載體是將目的基因插入pCAMBIA1381或pJim19質(zhì)粒的多克隆位點間得到的重組表達(dá)載體。

7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述水稻花序為在初花期經(jīng)人工授粉后的花序；所述浸漬或淋沖是在自所述人工授粉時起的3小時內(nèi)進(jìn)行的。

8.如權(quán)利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述浸漬或淋沖的時間為20-40秒，優(yōu)選是30秒。

9.如權(quán)利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于：所述方法還包括在所述收獲種子步驟之后進(jìn)行種子萌發(fā)，得到轉(zhuǎn)基因水稻；所述方法優(yōu)選還包括在所述種子萌發(fā)后的篩選，所述篩選包括如下步驟：在所述收獲種子后，將種子在含有潮霉素的抗性培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選；所述潮霉素在所述抗性培養(yǎng)基中的濃度為40-60mg/L，優(yōu)選是50mg/L；所述抗性篩選時間為20-30天。

10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：所述篩選還包括所述抗性篩選后的分子生物學(xué)檢測，優(yōu)選是PCR檢測、Southern?blot檢測和/或Western?blot檢測；所述PCR檢測的引物是檢測潮霉素抗性標(biāo)記基因的引物和/或檢測目的基因的引物。