[發明專利]耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法

無效

• 申請號: 201010271452.5
• 申請日: 2010-09-03
• 公開（公告）號: CN101962631A
• 公開（公告）日: 2011-02-02
• 發明（設計）人: 孫建華;曲曉軍;于沖;夏海華;王金英;齊桂云;佟忠山;郭薇媛
• 申請（專利權）人: 黑龍江省科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 金永煥

技術領域

本發明涉及噬菌體的制備方法。

背景技術

在臨床上由于抗生素的濫用導致細菌耐藥性不斷增長，使得細菌感染性疾病特別是耐藥性細菌的感染問題成為臨床治療的全球性難題。銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa.PA)又稱綠膿桿菌是臨床上獲得性感染中重要的條件致病菌之一。我國全國性醫院內病原菌耐藥性監測(NPRS)數據顯示：銅綠假單胞菌在所有院內感染革蘭陰性菌中排第1位，隨著抗生素的應用日益廣泛，臨床上出現了大量多重耐藥的PA菌株，這對臨床治療PA感染造成極大的困難。

噬菌體是專性寄生物，所以自然界中凡有細菌分布的地方，均可發現其特異的噬菌體的存在，亦即噬菌體是伴隨著宿主細菌的分布而分布的，例如糞便、陰溝污水及醫院污水中含有大量綠膿桿菌，故也能很容易地分離到綠膿桿菌噬菌體。噬菌體是以特定的細菌菌株為靶標，可使患者免受因正常菌群被破壞而引起的副作用.噬菌體的另一優點是它們能夠以指數生長，會緊隨細菌增殖而生長、隨細菌消失而消失.并且噬菌體還能在細菌進化的同時發生突變，即使細菌對一種噬菌體產生耐受，自然界還存在著大量的甚至能進行更新的耐受菌的噬菌體種類.

由于噬菌體侵入細菌細胞后進行復制而導致細胞裂解，噬菌體即從中釋放出來，所以，(a)在液體培養基內可使混濁的菌懸液變為澄清，此現象可指示有噬菌體存在；也可利用這一特性，在樣品中加入敏感菌株與液體培養基，進行培養，使噬菌體增殖、釋放，從而可分離到特異的噬菌體；(b)在有宿主細菌生長的固體瓊脂平板上，噬菌體可裂解細菌而形成透明的空斑，稱噬菌斑，一個噬菌體產生一個噬菌斑，利用這一現象可將分離到的噬菌體進行純化與測定噬菌體的效價。對于分離到的綠膿桿菌噬菌體，再經過進一步篩選，應用綠膿桿菌的11個標準型，對噬菌體進行寬噬篩選，為下一步研究綠膿桿菌噬菌體外用制劑奠定基礎，綠膿桿菌噬菌體只是外用制劑中幾種成分之一。

目前，有關噬菌體方面的科研工作，開展的比較多，主要集中在噬菌體的性質及分類方法方面，在實際應用的分離方法方面，特別是針對某一種噬菌體，例如綠膿桿菌噬菌體的分離方法多種多樣，參差不齊，分離純化效果不理想(離心條件控制不精確，將導致分離的噬菌體斷裂等)，使后續科研工作困難重重。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有綠膿桿菌噬菌體的分離方法存在分離純化效果差的問題，而提供耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法。

耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法按以下步驟進行：一、取1L醫院污水，紗布過濾后加入CaCl₂至濃度為1mmol/L，攪拌后離心并取上清液，得污水樣品；二、向500ml三角瓶中加100ml三倍濃縮的牛肉膏蛋白胨液體培養基、200ml污水樣品和2ml綠膿桿菌菌懸液，然后在37℃搖床160r/min震蕩增殖培養12～24h，離心后取上清液并過濾，再在37℃下培養過夜，經無菌檢查合格，得裂解液；三、取一環裂解液接種于LB液體培養基內，然后加入0.1ml濃度為10⁷～10⁸pfu/ml的綠膿桿菌宿主菌懸液，室溫下混合15min，得混合液；四、取LB培養基溶化并冷卻至48℃，然后加入0.2ml混合液并混勻，再倒入LB固體培養基上并于37℃下培養24h，得單個噬菌斑；五、用接種針在單個噬菌斑中刺一下，取噬菌體，然后接入含有綠膿桿菌的LB液體培養基內，于37℃下培養至綠膿桿菌完全溶解，過濾后，即完成耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備。

本發明中綠膿桿菌噬菌體的制備方法簡單，且分離純化效果好，無噬菌體斷裂的現象。本發明制備所得耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體，用于制作自身(疫苗)生物制劑，治療耐藥綠膿桿菌感染引起的疾病，尤其是表皮感染性疾患，作為外用噴劑使用，可避免由于使用抗生素而產生的耐藥性綠膿桿菌。

附圖說明

圖1為具體實施方式中一噬菌體的透視電鏡圖。

具體實施方式

本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。