[發明專利]耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法

無效

• 申請號: 201010271452.5
• 申請日: 2010-09-03
• 公開（公告）號: CN101962631A
• 公開（公告）日: 2011-02-02
• 發明（設計）人: 孫建華;曲曉軍;于沖;夏海華;王金英;齊桂云;佟忠山;郭薇媛
• 申請（專利權）人: 黑龍江省科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 金永煥

1.耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法按以下步驟進行：一、取1L醫院污水，紗布過濾后加入CaCl₂至濃度為1mmol/L，攪拌后離心并取上清液，得污水樣品；二、向500ml三角瓶中加100ml三倍濃縮的牛肉膏蛋白胨液體培養基、200ml污水樣品和2ml綠膿桿菌菌懸液，然后在37℃搖床160r/min震蕩增殖培養12～24h，離心后取上清液并過濾，再在37℃下培養過夜，經無菌檢查合格，得裂解液；三、取一環裂解液接種于LB液體培養基內，然后加入0.1ml濃度為10⁷～10⁸pfu/ml的綠膿桿菌宿主菌懸液，室溫下混合15min，得混合液；四、取LB培養基溶化并冷卻至48℃，然后加入0.2ml混合液并混勻，再倒入LB固體培養基上并于37℃下培養24h，得單個噬菌斑；五、用接種針在單個噬菌斑中刺一下，取噬菌體，然后接入含有綠膿桿菌的LB液體培養基內，于37℃下培養至綠膿桿菌完全溶解，過濾后，即完成耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備。

2.根據權利要求1所述的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于步驟一中離心采用5000r/min的轉速離心15min。

3.根據權利要求1或2所述的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于步驟二中綠膿桿菌菌懸液的制備：綠膿桿菌接種于LB固體培養基上，37℃下培養17～26h，取單菌落接種于5ml無菌水中，即完成。

4.根據權利要求3所述的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于步驟二中離心采用5000r/min的轉速離心20min。

5.根據權利要求4所述的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于步驟二中過濾采用孔徑為0.22μm的濾菌器。

6.根據權利要求5所述的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于步驟二中無菌檢查的過程：在LB固體培養基上涂布50u?l濃度為10⁷～10⁸pfu/ml的綠膿桿菌宿主菌懸液，待綠膿桿菌宿主菌懸液干后，在上面分散滴加裂解液，然后在37℃下培養過夜，若形成無菌生長的透明噬菌斑，則裂解液中含有綠膿桿菌噬菌體，即完成；其中LB固體培養基為每1000mL由10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、12.5g的瓊脂、10g的NaCl和余量的水組成，pH值為7.5。

7.根據權利要求6所述的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于步驟三中綠膿桿菌宿主菌懸液的制備：取綠膿桿菌宿主菌單菌落接種于5mlLB液體培養基中，37℃搖床160r/min培養8～18h，即完成。

8.根據權利要求7所述的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于步驟三中LB液體培養基為每1000mL由10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、10g的NaCl和余量的水組成，pH值為7.5。

9.根據權利要求8所述的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于步驟三中LB培養基為每1000mL由10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、0.7g的瓊脂、10g的NaCl和余量的水組成，pH值為7.5。