[發明專利]一種高產L-丙氨酸的XZ-A26菌株及構建方法與應用

無效

• 申請號: 201010271301.X
• 申請日: 2010-08-31
• 公開（公告）號: CN101974476A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 張學禮
• 申請（專利權）人: 安徽華恒生物工程有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/63;C12N15/09;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 合肥天明專利事務所 34115
• 代理人: 奚華保

技術領域

本發明涉及一種高產L-丙氨酸的XZ-A26菌株，屬大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)，該菌株于2010年7月26日保藏在位于“北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所”的“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCC?No.4036。本發明還涉及該菌株的構建方法及該菌株在制備L-丙氨酸中的應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

L-丙氨酸在食品和醫藥領域有著廣泛的用途。在食品領域，L-丙氨酸的添加可明顯提高食品及飲料中的蛋白質利用率，食用后能迅速恢復疲勞，振奮精神。L-丙氨酸可提高腌制品的腌制效果并改善風味，提高含醇飲料的質量等。L-丙氨酸具有獨特的改善風味效果，它與其它氨基酸配合能加強食品、飲料風味。它還可以改善有機酸的酸味，添加后能使有機酸更接近天然果酸的酸味。在醫藥領域，L-丙氨酸是合成維生素B6的重要原料，同時也是營養劑補糖氨基酸營養輸液的主要成分。由L-丙氨酸組成的復合氨基酸注射液-《14氨基酸注射液-800》是主治肝腦病新藥，可治療肝功能不全時氨基酸代謝紊亂，促使肝昏迷病人蘇醒。L-丙氨酸還是一種很好的利尿藥。

目前L-丙氨酸的生產是以天門冬氨酸為原料，通過酶催化技術(天冬氨酸脫羧酶)來生產。由于天冬氨酸的生產是以順酐為原料的，因此L-丙氨酸的生產成本及售價嚴重依賴于石油價格。目前國內L-丙氨酸生產廠家均是使用酶催化技術。

微生物發酵法生產L-丙氨酸和酶催化技術相比有諸多優點：首先，用葡萄糖代替天冬氨酸作為生產原料。酶催化技術以天冬氨酸為原材料。目前天冬氨酸的生產是以順酐為原料，順酐的資源緊張和價格高漲導致天冬氨酸的供給也存在著巨大的隱患。微生物發酵法技術是以葡萄糖為原料。葡萄糖屬于可再生生物質資源，目前主要是通過玉米淀粉制得，將來可以從木質纖維素中提煉，成本可以長期保持在穩定的水平。利用葡萄糖為原材料，既有很大的價格優勢，又能長期維持價格的穩定。

其次，用微生物發酵法技術代替酶催化技術。酶催化技術需要對菌株進行高密度培養，分泌出生產L-丙氨酸所需的天冬氨酸脫羧酶。該過程對氧氣的需求量很大；另外，由于天冬氨酸脫羧酶基因是克隆在質粒上進行高表達的，因此在菌株培養過程中，需要添加抗生素來維持質粒的穩定遺傳復制。這些因素導致酶催化生產工藝復雜。微生物發酵法生產工藝簡單，只需在起始階段往發酵罐中投加葡萄糖和無機鹽，并接入少量的菌種。另外，微生物發酵法和酶催化技術相比，其最終發酵液中雜質少很多，這既可以節約L-丙氨酸的分離提取成本，也可以節約廢水處理的成本。

發明內容

本發明的目的在于提供一種通過生物發酵法生產高濃度L-丙氨酸的大腸桿菌(Escherichia?coli)基因工程菌XZ-A26，該菌株保藏號為CGMCC?No.4036，其具有將糖類原料發酵產生高濃度L-丙氨酸的能力，其是通過將嗜熱脂肪地芽孢桿菌染色體上的L-丙氨酸脫氫酶基因整合在大腸桿菌ATCC?8739染色體的乳酸脫氫酶處，再依次敲除所得大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在發酵罐中連續傳代培養而得的基因工程菌(如附圖1)。

本發明的另一個目的是提供上述菌株的構建方法，其包括下述步驟：

(1)L-丙氨酸脫氫酶基因的整合：將大腸桿菌ATCC?8739的乳酸脫氫酶基因ldhA擴增并克隆到pEASY-T1克隆載體上，得質粒pXZ-A01；將含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖轉移酶基因sacB的DNA片段連接至質粒pXZ-A01的DNA擴增片段上，得到質粒pXZ-A02；將質粒pXZ-A02的DNA擴增片段電轉至帶有pKD46質粒的大腸桿菌ATCC?8739，篩選卡那霉素抗性的菌落，得菌株XZ-A01；將擴增的L-丙氨酸脫氫酶基因連接至質粒pXZ-A01的DNA片段，得到質粒pXZ-A03；然后將質粒pXZ-A03的DNA擴增片段電轉至帶有pKD46質粒的XZ-A01，培養篩選在蔗糖中不能生長的菌落，得菌株XZ-A02；

(2)依次敲除上述所得大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因；