[發明專利]一種高產L-丙氨酸的XZ-A26菌株及構建方法與應用

無效

• 申請號: 201010271301.X
• 申請日: 2010-08-31
• 公開（公告）號: CN101974476A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 張學禮
• 申請（專利權）人: 安徽華恒生物工程有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/63;C12N15/09;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 合肥天明專利事務所 34115
• 代理人: 奚華保

1.一種高產L-丙氨酸的XZ-A26菌株，保藏號為CGMCC?No.4036，其具有發酵產生高濃度L-丙氨酸的能力，其是通過將嗜熱脂肪地芽孢桿菌染色體上的L-丙氨酸脫氫酶基因整合在大腸桿菌ATCC?8739染色體的乳酸脫氫酶處，再依次敲除所得大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在發酵罐中連續傳代培養而得的基因工程菌。

2.權利要求1的保藏號為CGMCC?No.4036的XZ-A26菌株的構建方法，包括下述步驟：(1)L-丙氨酸脫氫酶基因的整合：將大腸桿菌ATCC?8739的乳酸脫氫酶基因擴增并克隆到pEASY-T1克隆載體上，得質粒pXZ-A01；將含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖轉移酶基因sacB的DNA片段連接至質粒pXZ-A01的DNA擴增片段上，得到質粒pXZ-A02；將質粒pXZ-A02的DNA擴增片段電轉至帶有pKD46質粒的大腸桿菌ATCC?8739，篩選卡那霉素抗性的菌落，得菌株XZ-A01；將擴增的L-丙氨酸脫氫酶基因連接至質粒pXZ-A01的DNA片段，得到質粒pXZ-A03；然后將質粒pXZ-A03的DNA擴增片段電轉至帶有pKD46質粒的XZ-A01，培養篩選在蔗糖中不能生長的菌落，得菌株XZ-A02；其中，乳酸脫氫酶基因ldhA的擴增引物、質粒pXZ-A02的DNA擴增引物以及質粒pXZ-A03的DNA擴增引物為核苷酸序列表中序列3和序列4，質粒pXZ-A01的DNA擴增引物為核苷酸序列表中序列5和序列6，L-丙氨酸脫氫酶基因擴增引物為核苷酸序列表中序列1和序列2；

(2)依次敲除上述所得大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因；

丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除：將菌株XZ-A02的丙酮酸甲酸裂解酶基因擴增并克隆到pEASY-T1克隆載體上，得質粒pXZ-A04；將含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖轉移酶基因sacB的DNA片段連接至質粒pXZ-A04的DNA擴增片段上，得到質粒pXZ-A05；將質粒pXZ-A05的DNA擴增片段電轉至帶有pKD46質粒的菌株XZ-A02，篩選卡那霉素抗性的菌落，得菌株XZ-A03；將質粒pXZ-A04的DNA擴增片段進行磷酸化處理后自連得到質粒pXZ-A06；然后將質粒pXZ-A06的DNA擴增片段電轉至帶有pKD46質粒的XZ-A03，培養篩選在蔗糖中不能生長的菌落，得菌株XZ-A04；其中，丙酮酸甲酸裂解酶基因的擴增引物、質粒pXZ-A05的DNA擴增引物以及質粒pXZ-A06的DNA擴增引物為核苷酸序列表中序列7和序列8，質粒pXZ-A04的DNA擴增引物為核苷酸序列表中序列9和序列10；

乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因的敲除：按照丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除方法，以所得菌株XZ-A04為起始原料進行乙醇脫氫酶基因的敲除，得到菌株XZ-A06；然后以XZ-A06為原料進行乙酸激酶基因的敲除，得到菌株XZ-A08；再以XZ-A08為原料進行富馬酸還原酶基因的敲除，得到菌株XZ-A10；再以XZ-A10為原料進行丙氨酸消旋酶基因的敲除，得到菌株XZ-A12；

其中，所用乙醇脫氫酶基因的擴增引物、質粒pXZ-A08的DNA擴增引物以及質粒pXZ-A09的DNA擴增引物為核苷酸序列表中序列11和序列12，質粒pXZ-A07的DNA擴增引物為核苷酸序列表中序列13和序列14；

乙酸激酶基因的擴增引物、質粒pXZ-A11的DNA擴增引物以及質粒pXZ-A12的DNA擴增引物為核苷酸序列表中序列15和序列16，質粒pXZ-A10的DNA擴增引物為核苷酸序列表中序列17和序列18；

富馬酸還原酶基因的擴增引物、質粒pXZ-A14的DNA擴增引物以及質粒pXZ-A15的DNA擴增引物為核苷酸序列表中序列19和序列20，質粒pXZ-A13的DNA擴增引物為核苷酸序列表中序列21和序列22；

丙氨酸消旋酶基因的擴增引物、質粒pXZ-A17的DNA擴增引物以及質粒pXZ-A18的DNA擴增引物為核苷酸序列表中序列23和序列24，質粒pXZ-A16的DNA擴增引物為核苷酸序列表中序列25和序列26；

(3)在發酵罐中連續傳代培養步驟(2)所得菌XZ-A12得到菌株XZ-A26。