[發明專利]含基底膜的組織工程皮膚及其構建方法

有效

• 申請號: 201010271010.0
• 申請日: 2010-08-31
• 公開（公告）號: CN101954124A
• 公開（公告）日: 2011-01-26
• 發明（設計）人: 紀世召;夏照帆;肖仕初;李恒宇;王光毅;楊曉妍;羅鵬飛
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: A61L27/60
• 分類號: A61L27/60;C12N5/071
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司 31204
• 代理人: 丁振英

技術領域

本發明涉及組織工程和醫學創面修復技術領域，具體涉及一種將羊膜表面修飾改性后作為基底膜，復合血漿為基質，經體外培養構建含基底膜的組織工程皮膚(即活性皮膚替代物)，特別適用于燒傷、創傷的皮膚缺損修復及瘢痕整形。

背景技術

目前，以聚乳酸、聚羥基乙酸、膠原、透明質酸等生物可降解材料構建真皮支架，在此基礎上構建活性皮膚替代物，已初步應用于深度皮膚缺損創面的修復及疤痕整形等。但由此構建的皮膚替代物一方面基質材料提取困難，制作工藝復雜，費用昂貴，難以在臨床廣泛推廣應用，另一方面其不具備皮膚的基底膜結構，導致愈合皮膚不耐壓和耐磨，表皮粘附不牢，容易脫落破損或形成水皰，且影響正常表皮結構、形態的發育。而異體脫細胞真皮取自尸體皮，來源有限，價格昂貴，限制了其臨床推廣應用。

人羊膜組織為含單層上皮細胞的半透明組織，無血管、神經、淋巴管，厚度為0.02-0.5mm，其基底膜的形態與皮膚基底膜非常相似，且主要由層粘連蛋白和IV型膠原組成(趙敏，魯靜，張琪，等.HGF、bFGF、ColIV、LN在保存羊膜中的表達.眼科研究，2006，24(5)：514-517.)。此外人羊膜是醫療廢棄組織，來源廣泛，取材方便，其作為一種生物敷料較早用于燒傷創面的覆蓋，不僅可以降低創面的炎癥促進上皮化而且可以抑制瘢痕的形成。目前已有商品化的羊膜產品如江西瑞濟生物工程技術有限公司的冷凍干燥生物羊膜。

國內外尚無文獻報道將羊膜作為基底膜，復合血漿為基質，經體外培養構建含基底膜的組織工程皮膚。

發明內容

本發明目的在于提供一種以表面修飾改性的羊膜為基底膜，，以自體/異體血漿為基質的皮膚替代物，及其構建方法。本發明材料來源廣泛，制備方法簡單，成本低廉，可在體內移植中保持完整的基底膜和半橋粒，加速并促進表皮結構形態的形成。

本發明的以表面修飾改性的羊膜為基底膜，血漿為基質的含基底膜的組織工程皮膚的構建方法，包括如下步驟：

A)分離、培養角朊細胞、成纖維細胞(參考：劉德伍，李國輝，鄒萍，劉德明.表皮細胞、成纖維細胞復合脫細胞真皮基質構建組織工程皮膚.中國臨床康復，2004，8(8)：1439-1441.)。

B)表面修飾改性羊膜：

去除絨毛膜后的羊膜，經生理鹽水反復浸泡、清洗后，于0.02％的EDTA溶液37℃消化2小時，超聲振蕩洗滌徹底除去殘留的細胞碎片及絨毛膜組織，置于含1000U/ml慶大霉素、2.5g/ml兩性霉素B的生理鹽水中浸泡20至50分鐘。

C)構建組織工程皮膚；

將B)步驟制備的羊膜與含成纖維細胞的血漿基質復合，再將角朊細胞以1-5×10⁵個/cm²的密度接種于羊膜表皮面，體外培養2-3周。

本發明的構建方法具體步驟如下：

1、分離、培養人角朊細胞、成纖維細胞

利用包皮環切術后廢棄包皮組織或者整形術后多余皮膚組織，分別采用酶消化法及組織塊貼壁法分離、培養角朊細胞和成纖維細胞。分別制備成單細胞懸液，按2-3×10⁵個/ml細胞密度接種于培養瓶中，置于37℃培養箱中，角朊細胞以無血清培養基培養，成纖維細胞以完全型DMEM培養液進行培養，當細胞達70％-80％融合時進行傳代、擴增。

2、表面修飾改性羊膜

無菌條件下剝離新鮮羊膜(取自肝炎病毒抗體、梅毒抗體及HIV均為陰性的剖腹產婦的胎盤組織)，鈍性分離絨毛膜，經生理鹽水反復浸泡、清洗后，于0.02％的EDTA溶液中，37℃消化2小時，隨后放入高頻超聲清洗器中超聲振蕩洗滌2小時，徹底除去殘留的細胞碎片及絨毛膜組織，然后經蒸餾水反復浸泡清洗后，置于含1000U/ml慶大霉素、2.5g/ml兩性霉素B的生理鹽水中浸泡30min制備表面修飾改性的羊膜。

3、構建組織工程皮膚

首先將制備的羊膜基底面向上鋪于培養板上，待其完全干燥貼壁。取患者或異體全血后離心獲取血漿，經微孔過濾器除去細胞碎片，將成纖維細胞加入制備的血漿中配制濃度為5×10⁵個/ml，充分混勻后加入上述鋪有羊膜的培養皿中。隨后以1∶40的體積比加入1M的氯化鈣溶液，促進其聚合，待其聚合成凝膠后，加入含20％胎牛血清的1×DMEM溶液，于體外培養3-5天。隨后將角朊細胞按1-5×10⁵個/cm²的密度接種于羊膜上，待細胞融合后，進行氣-液界面培養2-3周，每2～3天換液一次，形成以羊膜為基底膜，血漿凝膠為基質的活性皮膚替代物。