[發明專利]含基底膜的組織工程皮膚及其構建方法

有效

• 申請號: 201010271010.0
• 申請日: 2010-08-31
• 公開（公告）號: CN101954124A
• 公開（公告）日: 2011-01-26
• 發明（設計）人: 紀世召;夏照帆;肖仕初;李恒宇;王光毅;楊曉妍;羅鵬飛
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: A61L27/60
• 分類號: A61L27/60;C12N5/071
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司 31204
• 代理人: 丁振英

1.一種含基底膜的組織工程皮膚的構建方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

A)分離、培養角朊細胞、成纖維細胞；

B)表面修飾改性羊膜：

去除絨毛膜后的羊膜，經生理鹽水反復浸泡、清洗后，于0.02％的EDTA溶液37℃消化2小時，超聲振蕩洗滌徹底除去殘留的細胞碎片及絨毛膜組織，置于含1000U/ml慶大霉素、2.5g/ml兩性霉素B的生理鹽水中浸泡20至50分鐘；

C)構建組織工程皮膚；

將B)步驟制備的羊膜與含成纖維細胞的血漿基質復合，再將角朊細胞以1-5×10⁵個/cm²的密度接種于羊膜表皮面，體外培養2-3周。

2.根據權利要求1所述的含基底膜的組織工程皮膚的構建方法，其特征在于該方法的具體步驟如下：

A)分離、培養人角朊細胞、成纖維細胞：

利用包皮環切術后廢棄包皮組織，采用酶消化法分離、培養角朊細胞、成纖維細胞，分別制備成單細胞懸液，按2-3×10⁵個/ml細胞密度接種于培養瓶中，置于37℃培養箱中，角朊細胞以無血清培養基培養，成纖維細胞以完全型DMEM培養液進行培養，當細胞達70％-80％融合時進行傳代、擴增；

B)表面修飾改性羊膜：

無菌條件下剝離新鮮羊膜，鈍性分離絨毛膜，經生理鹽水反復浸泡、清洗后，于0.02％的EDTA溶液中，37℃消化2小時，隨后放入高頻超聲清洗器中超聲振蕩洗滌2小時，徹底除去殘留的細胞碎片及絨毛膜組織，然后經蒸餾水反復浸泡清洗后，置于含1000U/ml慶大霉素、2.5g/ml兩性霉素B的生理鹽水中浸泡30min備用；

C)構建組織工程皮膚：

將步驟B)制備的羊膜基底面向上鋪于培養板上，待其完全干燥貼壁，取患者或異體全血置于含枸櫞酸鈉抗凝劑的抗凝管中，600g離心5min，收集血漿，經20um孔徑的過濾器消毒除去細胞碎片，將成纖維細胞加入制備的血漿中配制濃度為5×10⁵個/ml，充分混勻后，以1∶6的體積(ml)與培養板面積(cm²)比將含成纖維細胞的血漿加入上述鋪有羊膜的培養皿中。隨后以1∶40的體積比加入1M的氯化鈣溶液，待其聚合成凝膠后，加入含20％胎牛血清的1×DMEM溶液，于體外培養3-5天；隨后將角朊細胞按1-5×10⁵個/cm²的密度接種于羊膜上，待細胞融合后，進行氣-液界面培養2-3周，每2～3天換液一次。

3.一種如權利要求1或2所述的方法構建的組織工程皮膚。

4.如權利要求3所述的組織工程皮膚在制備創面修復移植材料中的應用。