[發(fā)明專(zhuān)利]恩諾沙星殘留的時(shí)間分辨免疫分析檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010269007.5
• 申請(qǐng)日: 2010-08-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102135534A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫遠(yuǎn)明;雷紅濤;楊金易;沈玉棟;王弘;肖治理
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/543
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/543;G01N33/577;G01N1/28;G01N21/75;G01J1/00
• 代理公司: 廣州粵高專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種化學(xué)品污染殘留的檢測(cè)試劑盒及其制備方法，具體涉及一種檢測(cè)恩諾沙星殘留的時(shí)間分辨免疫分析試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)

食品安全是關(guān)系到廣大人民的日常生活的一件大事。食品安全問(wèn)題主要包括食品中的物理危害、化學(xué)危害和微生物危害等幾個(gè)因素，其中化學(xué)危害主要包括獸藥殘留、農(nóng)藥殘留、重金屬、環(huán)境有害物等。、

聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)殘留聯(lián)合立法委員會(huì)將獸藥殘留定義為：動(dòng)物產(chǎn)品的任何可食部分所含獸藥的母體化合物及其代謝物，以及獸藥有關(guān)的雜質(zhì)。獸藥殘留已成為困擾全世界食品安全的難題，也是各國(guó)用以設(shè)置貿(mào)易壁壘的最主要的手段之一。

恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)又名乙基環(huán)丙沙星，化學(xué)名為1-環(huán)丙基-7-(4-乙基-1-哌嗪基)-6-氟-1，4-二氫-4-氧代-3-喹啉羧酸。該藥物具有廣譜抗菌效果，對(duì)霉菌和革蘭氏陰性菌效力強(qiáng)，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和厭氧菌效果較弱；內(nèi)服及肌肉注射吸收迅速，且在體內(nèi)代謝為同樣具有抗菌活性的環(huán)丙沙星，代謝物生成與消除緩慢，分布廣泛。恩諾沙星分子結(jié)構(gòu)式如下：

恩諾沙星(Enrofloxacin)為一類(lèi)人工合成的新型殺菌性抗菌藥物，在獸醫(yī)臨床上得到廣泛應(yīng)用。然而在獸醫(yī)臨床應(yīng)用時(shí)所產(chǎn)生的耐藥性、殘留毒性以及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星對(duì)人體的不良反應(yīng)已引起廣泛關(guān)注。歐盟和WHO相繼規(guī)定了恩諾沙星在牛、豬和家禽中的最高殘留限量(MRLs)分別為30μg/kg和40μg/kg。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)不允許將恩諾沙星用于對(duì)家禽和水產(chǎn)品細(xì)菌感染的治療；日本厚生勞動(dòng)省也在該國(guó)食品衛(wèi)生法中禁止使用恩諾沙星等合成抗菌劑。目前，我國(guó)規(guī)定恩諾沙星在牛、豬、家禽肌肉中的MRLs為100μg/kg。由于動(dòng)物性食品中的獸藥殘留問(wèn)題越來(lái)越受到國(guó)際社會(huì)的關(guān)注，世界各國(guó)均加強(qiáng)了對(duì)國(guó)際貿(mào)易中動(dòng)物性食品中獸藥殘留的檢測(cè)。因此，為了保證動(dòng)物性食品的安全，保障消費(fèi)者健康，促進(jìn)國(guó)際貿(mào)易的順利開(kāi)展，建立動(dòng)物性食品中恩諾沙星的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)具有重要的意義。

現(xiàn)今，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了許多方法檢測(cè)動(dòng)物性食品中殘留的恩諾沙星，包括微生物檢測(cè)法、HPLC法、MS法和LC-MS等方法。其中微生物檢測(cè)法的檢測(cè)限常高于藥物的最大殘留量，不夠靈敏，且難以用于樣品的定性。儀器方法準(zhǔn)確、靈敏，但是由于價(jià)格昂貴、時(shí)間長(zhǎng)、技術(shù)要求高等原因從而限制其應(yīng)用于大批量樣品的篩選。目前常用的免疫分析方法有酶聯(lián)免疫吸附法(免疫分析)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)、時(shí)間分辨免疫分析(TRFIA)方法，其中時(shí)間分辨免疫分析(TRFIA)具有靈敏度高、快速、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便、分析結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，是目前最具有潛力的免疫分析方法之一。

時(shí)間分辨免疫分析(TRFIA)和通常的普通的熒光分析原理基本相同，只是TRFIA采用了一種特殊的標(biāo)記物標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽、激素、抗體、核酸探針或生物活性細(xì)胞，待反應(yīng)體系發(fā)生后，用時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定最后產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析的目的。

時(shí)間分辨免疫分析(TRFIA)是以鑭系元素如銪(Eu)、釤(Sm)、鏑(Dy)、鋱(Te)等稀土離子為標(biāo)記物，稀土離子需通過(guò)雙功能螯合劑的橋聯(lián)作用才能標(biāo)記抗原或抗體，雙功能螯合劑的一端與Eu³⁺等連接，另一端同抗原或抗體分子上的氨基連接。常用的螯合劑有N₂-[p-異硫氰酸-苯基]-二乙烯三胺四醋酸(DTTA)、異硫氰酸-苯基-EDTA及環(huán)化二乙烯三胺五醋酸酐(cDPTA)等，它們含有帶氨基羧酸或帶異硫氰酸基羧酸等活性基團(tuán)，有很強(qiáng)的螯合稀土元素的能力。

時(shí)間分辨免疫分析(TRFIA)根據(jù)免疫分析方法模式的不同可以分為競(jìng)爭(zhēng)法和夾心法兩種。

(1)競(jìng)爭(zhēng)法：主要用于小分子抗原、半抗原及一些抗體的檢測(cè)。包括直接競(jìng)爭(zhēng)法或間接競(jìng)爭(zhēng)法，直接競(jìng)爭(zhēng)法一般在微孔板預(yù)先包被第二抗體，先加入一定量的第一抗體和樣品，孵育洗滌后再加入Eu³⁺標(biāo)記的小分子抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合第一抗體。間接競(jìng)爭(zhēng)法一般在微孔板預(yù)先包被抗原，加入一定量的第一抗體和樣品，孵育洗滌后再加入Eu³⁺標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行示蹤。而在一些抗體的檢測(cè)中，標(biāo)記抗體和樣品中的抗體通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合一定量的中和抗原來(lái)進(jìn)行分析的。最后，通過(guò)孵育洗滌加入增強(qiáng)溶液，所測(cè)得的熒光強(qiáng)度與樣品的含量成反比，標(biāo)準(zhǔn)曲線為競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。