[發明專利]一種環氧水解酶基因、編碼蛋白及其應用

無效

• 申請號: 201010266947.9
• 申請日: 2010-08-27
• 公開（公告）號: CN102382847A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 范立強;賀婉紅;趙健;許建和
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/14;C12N15/63;C12N15/11;C12P41/00;C12P7/02;A01H5/00
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 31218
• 代理人: 翟羽

【技術領域】

本發明屬于生物化學與分子生物學中基因工程領域，更具體地講，涉及一種綠豆環氧水解酶基因及其編碼蛋白。

【背景技術】

手性環氧化物及其開環產物鄰二醇能與各種親核試劑反應，作為合成化學中重要的手性砌塊可以進一步轉化成許多具有生物活性的化合物，如白三烯、昆蟲信息素、甾類物質、β-腎上腺素阻斷劑、神經保護劑和艾滋病毒蛋白酶抑制劑等，在醫藥、農藥、精細化工和化妝品等行業具有廣闊的應用前景。在藥物研究領域，具有單一光學活性結構的藥物往往比具有消旋結構的藥物療效更高，不良反應更少，因此有機化學家、藥物化學家一直在致力于發展新的途徑和方法得到單一光學活性的化合物。

不對稱氧化及開環的方法，有化學催化和生物催化兩種。以Katsuki-Sharpless和Jacobsen不對稱環氧化為代表的含金屬元素類化學催化劑已廣泛應用于各種反應中。近年來，以水解酶類(特別是脂肪酶和酯酶)、鹵酸脫鹵素酶、單加氧酶、過氧化物酶、鹵過氧化物酶和環氧水解酶(Epoxide?hydrolases，EHs)為代表的生物催化劑依賴其高度立體選擇性、環境友好等優勢越來越得到重視，尤其是不依賴于輔因子的環氧化物水解酶[EC.3.3.2.X]。

環氧水解酶廣泛存在于自然界各種生物體內，如哺乳動物、植物、昆蟲、真菌和細菌等，能立體選擇性地將水分子加成到環氧底物上，生成相應的鄰位二醇。由于環氧具有張力三元環和極性碳氧鍵，是非常活潑的親電試劑，因此環氧化物在生物體內可以和許多具有親核基團的生物活性分子進行反應，EHs可以降解這種具有潛在毒性的代謝中間體，特別是那些可以致癌的多環芳烴環氧化物；EHs和血管滲透中內源的化學遞質如花生四烯酸、亞麻油酸等氧化脂類的代謝也有關，可防止形成的環氧化物導致的炎癥、組織缺氧、高血壓等生理機能障礙；多數植物種子含有含氧油脂，例如斑鳩菊脂酸、單加氧的亞麻油酸，它們經過環氧水解酶作用之后得到的相應的二醇是角質素和芳香族化合物合成中重要的中間體，也是植物抗真菌的防衛物。EHs對人體及其他生物體都非常重要。

環氧化物的酶促水解反應從20世紀60年代就有科學家開始研究，在自然界中尋找新的EHs酶源是近年來國際上研究的熱點。目前已發現了很多具有環氧化物選擇性水解活力的細菌、真菌和植物，見參考文件[1-7]，使EHs在不對稱合成中的運用成為可能；隨著基因組測序計劃的進行，EHs的來源也擴大到利用基因重組方法來制備，見參考文獻[8-11]，如黑曲霉、土豆、大豆等，且已有兩種重組EHs作為商品進行銷售。

一般而言，消旋化合物經酶促轉化拆分后最多只能得到50％的單一構型產物。對映體會聚(enantioconvergence)是指將兩種構型的外消旋底物同時轉化成一種構型的產物，可實現底物的完全轉化。常用的對映體會聚的方法有利用兩種選擇性互補的酶共同作用和化學-酶偶聯法兩種。我們已發現綠豆中存在獨特的環氧水解酶，見參考文獻[12-13]，可以通過對映歸一性水解的方式產生單一構型的鄰位二醇；對此酶進行了部分純化、動力學和酶學性質研究。本發明中公開綠豆環氧水解酶的基因與其編碼的蛋白序列，以及該酶的重組方法。

參考文獻：

[1]Christophe?Morisseau，Jeffrey?K.Beetham，Franck?Pinot?et?al.Cress?and?Potato?Soluble?Epoxide?Hydrolases：Purification，Biochemical?Characterization，and?Comparison?to?Mammalian?Enzymes.Archives?of?Biochemistry?and?Biophysics.2000，378(2)：321-332.

[2]Carel?A.G.M.Weijers?and?Jan?A.M.de?Bont.Epoxide?hydrolases?from?yeasts?and?other?sources：versatile?tools?in?biocatalysis?Journal?of?Molecular?Catalysis?B：Enzymatic.1999，6：199-214

[3]Martha?S.Smit.Fungal?epoxide?hydrolases：new?landmarks?in?sequence-activity?space.TRENDS?in?Biotechnology.2004，22(3)：123-129