[發明專利]基于納米微粒的生物標志物的化學發光檢測方法及應用

無效

• 申請號: 201010266812.2
• 申請日: 2010-08-27
• 公開（公告）號: CN102384905A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 蔡圣;劉彩云;盧建忠
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N33/577
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發明屬生物檢測技術領域，涉及重大疾病血清等生物樣本中標志物的檢測方法，具體涉及一種基于納米微粒的生物標志物的化學發光檢測方法及應用。本方法尤其能為臨床腫瘤等重大疾病的早期診斷，提供高靈敏度血清等生物樣本中標志物輔助判斷依據。?

背景技術

世界衛生組織(WHO)統計，每年世界范圍內有1000萬人罹患癌癥，死于癌癥的人數約6萬例左右，占全球死亡人數的12％。根據我國衛生部腫瘤防治辦公室提供的我國腫瘤發病率和十大惡性腫瘤發病率排序顯示：中國每年癌癥新發病例約為220萬人，因癌癥死亡人數為160萬人，平均每3分鐘就有1.3人死于癌癥，而且癌癥的發病率呈急劇上升趨勢。其中肺癌、乳腺癌分別位居男、女性惡性腫瘤發病首位，男女惡性腫瘤死亡率最高的均為肺癌。據《文匯報》報道，在過去不到20年的時間內，我國癌癥發病率上升69％，死亡率增長了29.4％，癌癥已經成為威脅人類健康的第一殺手。治療癌癥早期診斷是關鍵。按目前的醫療水平，早期癌癥病人約有80％-90％以上可以治愈，治療后不僅能提高生存率，同時提高患者的生存質量，因此，早期診斷對于癌癥患者具有十分重要的意義。?

肺癌是癌癥當中最常見、致死人數最多的惡性腫瘤之一，其發病率增長速度亦高居各惡性腫瘤之首?，F有技術公開了肺癌分為小細胞肺癌(smallcell?lung?cancer，SCLC)和非小細胞肺癌(non?small?cell?lung?cancer，NSCLC)，其中非小細胞肺癌約占肺癌總數的80％。由于肺癌起病隱匿，目前仍缺乏有效的篩查和早期診斷方法。臨床實踐顯示，患者出現癥狀時多為晚期，預后較差，總的5年生存率不超過15％，有癥狀者≤10％。有研究顯示，在早期診斷的肺癌患者中，手術治療的預后較中晚期肺癌明顯改善，其生存率可達70％。臨床傳統的診斷方法有胸片、支氣管鏡、痰細胞學檢查等方法，但均缺乏足夠的特異性和敏感性，大多數肺癌患者確診時已為晚期。因此，臨床急需一種能夠早期診斷肺癌、適合普遍推廣的超高靈敏度的新技術。?

近年來，在肺癌的輔助診斷方面，腫瘤標志物的研究十分活躍。腫瘤標志物是指在腫瘤發生和增殖過程中，由腫瘤細胞所產生或分泌并釋放到血液、細胞、體液中，反映腫瘤存在和生長的一類抗原物質。它具有高效、高靈敏、方便、標本易獲取及創傷小等優點，因此檢測、篩選及鑒定腫瘤標志物一直是肺癌早期診斷研究的研究重點。?

現有技術的腫瘤標志物檢測一般采用放射或酶聯免疫試劑盒，這些檢測方法普遍存在檢測靈敏度低，導致所需血清用量大、患者順應性差、檢測儀器成本高、維護費用高等不足，從而不利于它們在基層中小醫院臨床上的應用。生物芯片是近年來在生命科學領域中迅速發展起來的一項高新技術，具有高通量、微型化和自動化等特點，是醫學檢測的重要發展方向之一，但目前離臨床常規使用還有一段距離。?

發明內容

本發明的目的是為克服現有技術檢測生物標志物方法中檢測靈敏度低、血清用量大、檢測儀器復雜和診斷費用高等的不足，提供一種重大疾病血清等生物樣本中標志物的新的檢測方法，具體涉及一種基于納米微粒的生物標志物的化學發光檢測方法及應用。?

本發明方法中，在聚苯乙烯96孔板上共價固定特異性識別單克隆抗體，與相應的標志物結合，再與針對該標志物的適配體修飾的金納米微粒進行夾心反應；隨后采用NH₂OH/HAuCl₄放大經免疫反應結合的金納米微粒，進行標志物的高靈敏度化學發光檢測。本發明方法能夠識別、檢測多種重大疾病標志物。?

具體而言，本發明的基于納米微粒的生物標志物的化學發光檢測方法，其特征在于，其包括步驟：?

1)將包被抗體結合到聚苯乙烯96孔板上制備載體抗體復合物，封閉備用；?

2)制備金納米微粒；?

3)制備鏈霉親合素修飾的金納米微粒；?

4)制備針對目標抗原適配體DNA修飾的金納米微粒；?

5)NH₂OH/HAuCl₄放大后，加入魯米諾、AgNO₃底物進行化學發光測定。?

本發明中，使用聚苯乙烯96孔板作為載體結合包被抗體，與標準溶液或者血清等生物樣本中的標志物結合后，加入適配體修飾的金納米微粒，形成三明治復合物，經NH₂OH/HAuCl₄放大后，進行化學發光定量測定；?

本發明中，所述標志物的一端與包被抗體結合，另一端與針對該標志物?的適配體修飾的金納米微粒結合；?