[發(fā)明專利]一種生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010266589.1
• 申請日: 2010-08-24
• 公開（公告）號: CN102533892A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李剛;孫允武;朱占軍;馬正創(chuàng);解芳
• 申請（專利權(quán)）人: 青?？灯丈锟萍脊煞萦邢薰?/a>
• 主分類號: C12P17/06
• 分類號: C12P17/06;C12R1/465;C12R1/645
• 代理公司: 西寧金語專利代理事務(wù)所 63101
• 代理人: 哈慶華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種沙棘提取技術(shù)，具體地說是涉及一種沙棘葉中提取沙棘黃酮的生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法。

背景技術(shù)

沙棘是一種集醫(yī)療保健功能和生態(tài)環(huán)境改善功能為一體的具有極高使用價值的樹種，其果實、葉和莖皮中含有280多種化學(xué)成份，在綠色食品開發(fā)、醫(yī)療保健、疾病防治以及環(huán)境保護等方面都有良好的應(yīng)用前景。

黃酮類化合物是沙棘最重要的功能活性成分之一。對于黃酮類物質(zhì)，在沙棘的果實和葉中都存在，但是葉中的黃酮要多得多，而且活性更好的苷元型黃酮的量要更多。黃酮類物質(zhì)是色原酮或色原烷的衍生物，以C6-C3-C6結(jié)構(gòu)為基本母核的天然產(chǎn)物，即兩個苯環(huán)通過3個碳原子結(jié)合而成。其中C3部分可以是脂鏈，或與C6部分形成六元或五元氧雜環(huán)。黃酮類物質(zhì)主要由花色素、黃酮醇、黃酮、兒茶酚和黃烷酮組成，其中以黃酮醇類最為常見，其次是黃酮類，其余則較少見。多具有顏色。這些黃酮糖苷類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)又包括苷和苷元兩類，植物界中的黃酮類化合物大部分以糖苷的形式存在，一部分以游離苷元形式存在。由沙棘果和葉中提取的沙棘黃酮(酚類化合物)是許多化合物的總稱，其中包括主要三羥基苯并吡喃-4-酮，山柰黃酮醇，五羥基-2-苯基苯并-4-吡喃酮，六羥基2，3雙氫黃酮醇和三羥基黃酮等，構(gòu)成苷類的糖有：葡萄糖、異鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖，其存在形式為上述配基的糖苷。這些物質(zhì)對減少器質(zhì)性病變，諸如癌癥、動脈硬化的發(fā)病率起到了重要作用。通過系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)沙棘的葉子和果實中，幾乎所有的沙棘黃酮都是由三羥基苯并吡喃-4-酮、山柰黃酮醇，五羥基-2-苯基苯并-4-吡喃酮，六羥基2，3雙氫黃酮醇和三羥基黃酮這四種主要的苷元物質(zhì)和各種糖組成的糖苷型黃酮類化合物，游離的黃酮苷元很少。這種糖苷型的結(jié)構(gòu)使黃酮類化合物很穩(wěn)定，不易受環(huán)境影響而降解。自然界很多植物中的黃酮類化合物如大豆異黃酮，銀杏葉黃酮，竹葉黃酮等都是以這種糖苷型存在的。從動物體對黃酮的吸收率來看，黃酮在動物體內(nèi)的代謝途徑不相同，黃酮苷元可以直接被吸收進入動物血液中，黃酮苷元比黃酮糖苷具有更高的生物利用率。目前對于沙棘黃酮的需求逐漸增加，特別是沙棘黃酮中的主要成分三羥基苯并吡喃-4-酮，但是普通沙棘黃酮不能完全滿足醫(yī)藥中間體方面需要，特別是活性方面還存在很大的不足，因此利用生物轉(zhuǎn)化方法，提升沙棘黃酮中主要有效成分三羥基苯并吡喃-4-酮的含量成為十分迫切需要解決的問題。

目前黃酮在醫(yī)藥上應(yīng)用日益廣泛，尤其是沙棘黃酮的功效越來越受到重視。很多研究機構(gòu)和公司紛紛開始投入資金進行沙棘黃酮深入開發(fā)研究。但是到目前為止大部分工作僅僅限于沙棘黃酮的常規(guī)提取，利用生物轉(zhuǎn)化的方法，提升沙棘黃酮的功效及生產(chǎn)研究未見報道。國內(nèi)其他類似提取制備沙棘黃酮的項目多采用普通的溶劑直接提取，傳統(tǒng)的提取制備方法提取率不高，環(huán)境污染嚴重，制備的黃酮活性也比較低，國內(nèi)生物轉(zhuǎn)化普遍使用酶直接反應(yīng)，這樣不但造成酶的大量浪費，而且給后期分離純化帶來了很大問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法。

本發(fā)明一種生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)：本發(fā)明一種生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法，其特征在于：所述的方法包括如下步驟：

1)酶法生物轉(zhuǎn)化精提沙棘總黃酮步驟

選用合適的微生物對沙棘葉進行發(fā)酵處理；用半纖維素酶的生產(chǎn)菌株，生產(chǎn)所需要的專一性分離轉(zhuǎn)化三羥基苯并吡喃-4-酮的酶，對沙棘總黃酮進行精提；利用微生物產(chǎn)生的各種酶充分分解沙棘葉細胞壁，提高沙棘總黃酮的提取率；對沙棘葉總黃酮的微生物轉(zhuǎn)化方法進行優(yōu)化組合，獲得最大產(chǎn)率；

2)酶法轉(zhuǎn)化沙棘總?cè)~黃酮制備三羥基苯并吡喃-4-酮步驟

(a)L2001β-木聚糖酶：液體發(fā)酵鏈霉菌L2001發(fā)酵條件：農(nóng)業(yè)廢棄物復(fù)合碳源3％，酵母浸膏0.5％，蛋白胨1.0％，硫酸鎂0.05％，磷酸二氫鉀0.60％，磷酸氫二鉀0.15，40℃條件下140r/min培養(yǎng)，產(chǎn)生的耐熱β-木聚糖酶2000U/ml以上；菌株產(chǎn)酶周期6d；

(b)LM-9β-葡萄糖苷酶：固體發(fā)酵米曲霉LM-9發(fā)酵條件：麩皮與農(nóng)業(yè)廢棄物復(fù)合碳源組分比為2∶3，蛋白胨添加量為培養(yǎng)基干料的1％。營養(yǎng)鹽溶液(％)：硫酸鎂0.13％，磷酸氫二鉀6.5％，硫酸亞鐵0.001％，硝酸鈉0.2％，自然pH；料水比1∶4，30℃條件下培養(yǎng)，生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶2000U以上；菌株產(chǎn)酶周期6d；

(c)酶的固定化