[發(fā)明專利]一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010265842.1
• 申請(qǐng)日: 2010-08-30
• 公開（公告）號(hào): CN101899435A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳平華;方靜平;許莉萍;王恒波;陳由強(qiáng);陳如凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

1.一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特征在于：具體實(shí)施步驟如下：

（1）根據(jù)樣品數(shù)量，往1-45個(gè)2?mL的離心管中每管放入1粒4?mm直徑不銹鋼珠子；

（2）取50-100mg的新鮮甘蔗葉片放入各離心管中，蓋緊置于液氮中預(yù)凍30?min-45?min；

（3）取出后迅速放入-20℃預(yù)凍的球磨機(jī)配套45孔研磨支架上，在球磨機(jī)里打磨30?s-40?s，取出離心管置于冰上；

（4）往各離心管中加人1.0?mL經(jīng)65℃預(yù)熱的提取緩沖液；

（5）將離心管在65℃水浴40?min，期間每隔5?min顛倒混合一次離心管；????（6）每管加入800μL酚﹕氯仿﹕異戊醇混合液，三種溶劑的體積比25﹕24﹕1，顛倒混勻至乳白色，室溫靜置10?min，12,000?r/min離心10?min，取800μL上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，可重復(fù)抽提一次；

（7）加入占上清液2/3體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，顛倒混合，12,000?r/min離心10?min，棄上清液，或?qū)㈦x心管置于-20℃冰柜中1?h，用干凈tip頭或牙簽挑出絮狀DNA；

（8）加入體積濃度為75%乙醇600-1000μL，顛倒清洗DNA，12,000?r/min離心2-3?min，棄上清液，重復(fù)操作一次；

（9）DNA完全晾干后加入100μL雙蒸水或TE溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特征在于：所用球磨機(jī)為美國(guó)BioSpec?Products,Inc.生產(chǎn)的Mini-Beadbeater?96或其它原理相同的通過改變磁場(chǎng)引致金屬珠子高速往復(fù)運(yùn)行的研磨儀器。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特征在于：所用直徑4?mm不銹鋼珠子為鋼制珠子，可以在球磨機(jī)內(nèi)高速往復(fù)運(yùn)動(dòng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特征在于：葉片用量為50-100mg，不宜太多或太少，否則研磨不徹底或提取DNA量少。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特征在于：球磨機(jī)里打磨時(shí)間在30?s-40?s，不宜太長(zhǎng)，否則DNA易降解。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，其特征在于：所述步驟4）中的提取緩沖液由2?%?CTAB，20?mmol/L?EDTA，0.1mol/L?Tris-HCl，1.4mol/L?NaCl組成，pH=8.0。