[發(fā)明專利]一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010265842.1
• 申請(qǐng)日: 2010-08-30
• 公開（公告）號(hào): CN101899435A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳平華;方靜平;許莉萍;王恒波;陳由強(qiáng);陳如凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物領(lǐng)域，更具體涉及一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法。

背景技術(shù)

植物DNA的提取與動(dòng)物不同，植物細(xì)胞與組織具有較硬的細(xì)胞壁，往往含有大量的RNA、蛋白質(zhì)、多糖、單寧和色素等雜質(zhì)，這些問題給DNA的提取與純化帶來(lái)許多困難。在實(shí)際操作中，大多數(shù)蛋白質(zhì)可通過酚、氯仿等處理后變性、沉淀除去，絕大部分RNA可通過RNase?A除去。但多糖類雜質(zhì)一般較難去除，這些雜質(zhì)濃度高時(shí)，常常使DNA提取物呈膠狀，低濃度下也會(huì)干擾后續(xù)操作及分光光度法對(duì)核酸的定量分析。因此，獲得高質(zhì)量、高純度的DNA是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。在大多數(shù)植物的DNA提取方法中，CTAB法和SDS法是目前最為常用的兩種方法。然而不同植物由于具體內(nèi)含物含量不同，在實(shí)際操作過程中，往往要在原有方法基礎(chǔ)上加以改進(jìn)方能得到高質(zhì)量的DNA。

甘蔗是禾本科甘蔗屬植物，原產(chǎn)于熱帶、亞熱帶地區(qū)。甘蔗是一種高光效的植物，不僅是食糖業(yè)的重要原料，而且是能源、纖維、糖基化工和飼料的原料。目前，甘蔗種質(zhì)資源包括甘蔗原種、地方品種、雜交品種以及甘蔗的野生近緣植物、育種中間材料等。近幾十年來(lái)由于優(yōu)良種質(zhì)的研究貧乏，可利用雜交親本少，后代都可以追朔到幾個(gè)有限的親本，所以得到的后代親緣關(guān)系近，遺傳背景狹窄，使甘蔗育種日益面臨“瓶頸效應(yīng)”，限制了甘蔗產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，對(duì)甘蔗的研究已深入到分子水平，以PCR為基礎(chǔ)的多種分子標(biāo)記技術(shù)如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomly?amplified?polymorphic?DNA，RAPD)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列?(simple?sequence?repeats，SSR)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified?fragment?length?polymorphisms，AFLP)等已經(jīng)廣泛應(yīng)用于甘蔗的遺傳多樣性、種植資源評(píng)價(jià)、指紋圖譜建立、性狀連鎖標(biāo)記與輔助選擇等研究，而開展這些研究的基礎(chǔ)是獲得高質(zhì)量、高純度的DNA。由于甘蔗富含多糖、纖維、酚類、醌類、色素等物質(zhì)，所以甘蔗DNA的粗提物中經(jīng)常出現(xiàn)蛋白質(zhì)、多糖、色素等雜質(zhì)，抽提過程褐化明顯，提取的DNA存在濃度不高、純度低等缺陷。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了多種提取甘蔗DNA的方法，其中，最常采用的是液氮研磨法，在研缽中加入液氮快速研磨，由于甘蔗葉片韌度高，所以一般要加入液氮多次，直到葉片粉末顏色出現(xiàn)由綠變白的磨碎特征為止。這個(gè)過程耗力、耗時(shí)、不經(jīng)濟(jì)又繁瑣，每天提取的樣品數(shù)量非常有限；另外，由于一些分子分析方法如PCR對(duì)污染非常敏感，提取大批量材料時(shí)重復(fù)使用研缽?fù)鶗?huì)引起嚴(yán)重問題。隨著分子生物學(xué)的高速發(fā)展和適應(yīng)不同研究目的需要，提取DNA方法向著快速、簡(jiǎn)便、高效方向發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)了很多在傳統(tǒng)的SDS法、CTAB法基礎(chǔ)上的改良方法。但是這些方法偏重于提高制備DNA樣品的質(zhì)量，效率仍然很低，每天研磨的樣品數(shù)量有限，當(dāng)樣品量多時(shí)經(jīng)常需要數(shù)人一起操作，效率有待提高。美國(guó)一些研究單位目前采用球磨機(jī)提取DNA方法，效率可達(dá)每人每天上百份樣品。為了克服常規(guī)方法制備DNA模板存在的諸多不足，農(nóng)業(yè)部甘蔗遺傳改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室從美國(guó)引進(jìn)了球磨機(jī)配套提取DNA方法，以期高通量制備植物組織DNA，但在使用過程中出現(xiàn)了一些問題，主要是：引進(jìn)的球磨機(jī)配套提取DNA方案剪切葉片操作不方便，剪碎的葉片常常易散落管外；處理時(shí)間長(zhǎng)，損傷葉片易褐化；主要適用于溫室或苗圃小苗期的幼嫩葉片，對(duì)于韌度高、代謝旺盛的成熟甘蔗葉片效果不好；球磨機(jī)配套提取DNA方案中規(guī)定的葉片重量是200?mg，但一半以上甘蔗葉片無(wú)法磨碎，降低了提取的效率；球磨機(jī)配套提取DNA方案中采用美國(guó)Crosman公司生產(chǎn)的鋼珠，購(gòu)買不方便，且放置較長(zhǎng)時(shí)間后易生銹，常使DNA著色；打磨時(shí)間2?min得到的DNA片段長(zhǎng)度短，疑與研磨時(shí)間過長(zhǎng)有關(guān)。

綜上所述，引進(jìn)的球磨機(jī)提取DNA配套方案可能是一種通用的植物DNA提取方案，該方法直接應(yīng)用于甘蔗葉片基因組DNA提取時(shí)，存在不太適應(yīng)的現(xiàn)象，表現(xiàn)在上述提到的葉片前處理、葉片用量、研磨時(shí)間、鋼珠類型等方面均存在問題，導(dǎo)致提取的基因組DNA純度和濃度都很低，因此，需要針對(duì)甘蔗的特殊性進(jìn)行分離技術(shù)的優(yōu)化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提出一種利用球磨機(jī)高通量提取甘蔗葉片基因組的方法，針對(duì)甘蔗的特殊性進(jìn)行分離技術(shù)的優(yōu)化，從而克服了目前制備甘蔗DNA模板存在的磨樣麻煩、提取量低、純度不高等缺點(diǎn)。