[發明專利]一種提高水稻種子γ-氨基丁酸含量的方法

無效

• 申請號: 201010263299.1
• 申請日: 2010-08-26
• 公開（公告）號: CN101948855A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 開國銀;許輝;廖攀;張倩飛;黃志偉
• 申請（專利權）人: 上海師范大學
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N15/82;C12Q1/68;G01N33/53;G01N30/02;A01H5/00
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 楊杰民

技術領域

本發明涉及基因工程技術，具體地說是一種提高水稻種子γ-氨基丁酸含量的方法。

背景技術

γ-氨基丁酸（γ-amino?butyric?acid，GABA）是廣泛分布于動植物中的一種非蛋白質氨基酸，是生物體內的天然活性成分。γ-氨基丁酸在動物體內是一種抑制性神經傳遞物質，能介導中樞神經系統的抑制性神經傳導，系統地對腦血管進行調節。除腦和脊髓外，已在多種哺乳動物的近30種外周組織中發現γ-氨基丁酸（GABA）的存在。現有技術表明γ-氨基丁酸（GABA）是生物體內的生理活性成分，具有降血壓、抗焦慮、改善腦機能、增強長期記憶力的功能。所以γ-氨基丁酸（GABA）是一種很好的醫療藥物及保健品的原料。高血壓是危害人類健康的常見疾病，近十幾年來發病率逐步升高。現有技術治療高血壓藥物，效果都不理想。γ-氨基丁酸對于治療和預防高血壓疾病具有獨特的效果和巨大的應用潛力。

水稻是農業生產中的重要糧食作物，也是人類賴以生存的主要食品。水稻種子中含有數量有限的γ-氨基丁酸，不能滿足人類的保健要求。發明提供一種有效提高水稻種子中γ-氨基丁酸含量的方法，是非常有意義的。利用這種方法生產的產品，做為種子使用，具有遺傳功能，可以提高F ₁ 代稻谷中的γ-氨基丁酸含量；做為食物，可以充分利用γ-氨基丁酸（GABA）對人類的降血壓、抗焦慮、改善腦機能、增強長期記憶能力的藥理功效，促進人類健康，減輕心血管疾病的危害，延長人類壽命。

γ-氨基丁酸合成酶（GABA?synthase），也稱為谷氨酸脫羧酶（glutamate?decarboxylase，GAD），是合成γ-氨基丁酸的關鍵酶。水稻中有多種GAD基因，GAD2是其中的一種。日本學者Kazuhito?Akama研究發現，在水稻中過量表達OsGAD2DC，OsGAD2末端30個氨基酸缺失后，GABA的含量提高了100倍；證明了氨基酸序列C末端的30個氨基酸會抑制其自身的活性。這種方法在的缺點是：雖然在一定程度上提高了水稻中γ-氨基丁酸含量，但提高的是其在整個水稻植株中的含量；而且后代會出現矮化，白化，卷葉，不育等嚴重表型缺陷現象。RT-PCR分析結果，和水稻植株的其它組織相比，GAD2在成熟的種子中表達量低。

本發明利用基因工程方法，將5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列共同轉化水稻植株，不僅會使GAD2ΔC30特異地在水稻種子中表達；而且水稻種子中的γ-氨基丁酸（GABA）含量明顯提高；其后代表型正常。

經廣泛查閱國內外出版物，檢索國內外專利文獻，未發現與本發明主題和技術方案完全相同專利和技術文獻的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種提高水稻種子γ-氨基丁酸含量的方法。本發明涉及水稻種子特異性表達啟動子的克隆、關鍵酶基因序列GAD2ΔC30的克隆、載體構建、遺傳轉化、PCR及WesternBlot分子檢測、γ-氨基丁酸提取及含量測定，發明了提高水稻種子中γ-氨基丁酸GABA含量的方法，為γ-氨基丁酸大規模生產奠定了基礎。

本發明是通過以下技術方案實現的：

提高水稻種子γ-氨基丁酸含量的方法，包括以下步驟：

（1）從越光水稻中克隆5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列；

（2）把5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列連于表達調控序列，形成含有5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列的植物表達載體；

（3）將含5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列的植物表達載體轉化到根癌農桿菌，獲得含有5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列植物表達載體的根癌農桿菌菌株；

（4）將步驟（3）根癌農桿菌遺傳轉化水稻，獲得PCR及Western?Blot檢測陽性的轉基因水稻植株；