[發明專利]一種提高水稻種子γ-氨基丁酸含量的方法

無效

• 申請號: 201010263299.1
• 申請日: 2010-08-26
• 公開（公告）號: CN101948855A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 開國銀;許輝;廖攀;張倩飛;黃志偉
• 申請（專利權）人: 上海師范大學
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N15/82;C12Q1/68;G01N33/53;G01N30/02;A01H5/00
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 楊杰民

1.一種提高水稻種子γ-氨基丁酸含量的方法，包括以下步驟：

（1）從越光水稻中克隆5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列；

（2）把5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列連于表達調控序列，形成含有5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列的植物表達載體；

（3）將含5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列的植物表達載體轉化到根癌農桿菌，獲得含有5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列植物表達載體的根癌農桿菌菌株；

（4）將步驟（3）根癌農桿菌遺傳轉化水稻，獲得PCR及Western?Blot檢測陽性的轉基因水稻植株；

（5）對步驟（4）獲得的轉基因水稻植株種子中γ-氨基丁酸含量進行HPLC檢測，γ-氨基丁酸含量顯著提高，后代表型正常。

2.根據權利要求1所述的提高水稻種子γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于：步驟（1）從越光水稻中克隆的GAD2ΔC30序列是在GAD2基因的cDNA末端缺失90bp，終止密碼子TAG上游90bp的一段cDNA序列，編碼氨基酸序列為缺失C末端30個氨基酸的序列。

3.根據權利要求1所述的提高水稻種子γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于：步驟（2）中5.3kbGt1啟動子序列末端序列，距最末端一個堿基600bp處設計一條上游特異性引物及一條GAD2ΔC30序列的下游特異性引物，PCR方法對所述轉基因水稻進行分子檢測結果擴增出2013bp大小的特異DNA片段的陽性轉基因水稻植株。

4.根據權利要求1所述的提高水稻種子γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于：步驟（5）所述的HPLC法測定水稻種子中γ-氨基丁酸含量的方法為：

（1）色譜柱為Hypersil?ODS?C₁₈柱?125mm?×4.0mm?,5μm；

（2）流動相A醋酸鈉緩沖液的制備方法：取醋酸鈉2.72g?,三乙胺0.2mL?,加水溶解,冰醋酸調節pH至7.3,加水至1000mL；

（3）流動相B的制備方法：pH值7.2的1.35%醋酸鈉、乙腈、甲醇重量比為100∶175∶225；

（4）梯度洗脫0～4min,流動相B的比例從0.5%增加至26%?,維持6min后,增加至100%,維持7min；

（5）流速為1mL·min^-1；

（6）檢測波長338nm,柱溫40℃。