[發(fā)明專利]一種抗弧菌病的減毒活疫苗及其制備方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010260094.8
• 申請(qǐng)日: 2010-08-20
• 公開（公告）號(hào): CN101926986A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳后波;蘇曉波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所
• 主分類號(hào): A61K39/106
• 分類號(hào): A61K39/106;C12N15/11;C12N1/21;A61P31/04;C12R1/63
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及疫苗制備領(lǐng)域，具體涉及一種抗弧菌病的減毒活疫苗及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

弧菌病是海水養(yǎng)殖動(dòng)物中常見(jiàn)的流行病，在現(xiàn)有的技術(shù)中，目前只有鰻弧菌菌體疫苗的生產(chǎn)和應(yīng)用，尚未見(jiàn)弧菌減毒活疫苗的生產(chǎn)和應(yīng)用。鰻弧菌菌體疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中具有較專一的抗弧菌特異性，對(duì)抗鰻弧菌引起的疾病具有較高的抗性，但正是由于其作用專一，對(duì)其它弧菌致病菌引起的疾病的防御作用較差，在生產(chǎn)應(yīng)用中存在非常明顯的局限性。此外，傳統(tǒng)的細(xì)菌疫苗的生產(chǎn)工序上在最后環(huán)節(jié)加入滅活用藥物，殘留于疫苗中，導(dǎo)致存在副作用。因此，迫切需要一種可以對(duì)多種弧菌病均有抗性的、無(wú)副作用的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的抗弧菌病疫苗中存在的作用專一、對(duì)除鰻弧菌之外的弧菌引起的疾病的防御性較差、滅活用藥用殘留于疫苗中存在副作用的問(wèn)題，提供一種對(duì)多種弧菌病均有抗性的、無(wú)副作用的抗弧菌病的減毒活疫苗。

本發(fā)明另一目的在于提供上述抗弧菌病的減毒活疫苗的制備方法。

本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供上述抗弧菌病的減毒活疫苗的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明抗弧菌病的減毒活疫苗產(chǎn)生菌種為擬態(tài)弧菌(Vibrio?mimicus)，其特性能完全為作用動(dòng)物所接受。

本發(fā)明所述的抗海水養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病的減毒活疫苗的制備通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的：

1，線形打靶DNA的設(shè)計(jì)和制備。

2，含Red系統(tǒng)的宿主菌擬態(tài)弧菌的構(gòu)建。

3，電擊感受態(tài)擬態(tài)弧菌的制備。

4，電擊轉(zhuǎn)化。

5，基因敲除突變株的篩選。

6，突變株中抗性基因的剔除。

7，減毒活疫苗的制備。

本發(fā)明提供的減毒活疫苗的生產(chǎn)工藝，具體制備方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

(1)線形打靶DNA的設(shè)計(jì)和制備

設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物序列如SEQ?ID?NO：1～2所示，其中一條引物5’末端的40-50bp與外毒素基因5’端同源，3’與卡那霉素(Km)抗性基因同源；另一條引物5’末端的40-50bp與外毒素基因3’端同源，3’與卡那霉素(Km)抗性基因的另一端同源。以含卡那霉素(Km)抗性基因的質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出中間為卡那霉素(Km)抗性基因、兩端為40-50bp外毒素基因同源臂且含有FRT位點(diǎn)的線形打靶DNA。

(2)含Red系統(tǒng)的宿主菌擬態(tài)弧菌的構(gòu)建

將含有Red系統(tǒng)3個(gè)基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌擬態(tài)弧菌中，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度和加入誘導(dǎo)劑來(lái)控制Red系統(tǒng)的表達(dá)。本專利擬采用輔助質(zhì)粒pKD20，該質(zhì)粒含有整套R(shí)ed系統(tǒng)，有優(yōu)化的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，在阿拉伯糖啟動(dòng)子ParaB控制下高效表達(dá)λ蛋白、β蛋白和Exo核酸外切酶。此外，該質(zhì)粒還是一個(gè)溫度敏感性復(fù)制子，37℃生長(zhǎng)時(shí)就能輕易從宿主中消除。

(3)電擊感受態(tài)擬態(tài)弧菌的制備

將含Red系統(tǒng)的宿主菌擬態(tài)弧菌培養(yǎng)過(guò)夜，再將隔夜培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接到含卡那霉素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，在終止前不同時(shí)間加入不同量的L-阿拉伯糖來(lái)誘導(dǎo)Red系統(tǒng)的表達(dá)。離心收集菌體，制成所需的電擊感受態(tài)菌體。

(4)電擊轉(zhuǎn)化

利用電擊轉(zhuǎn)化的方法將線形打靶DNA轉(zhuǎn)入感受態(tài)擬態(tài)弧菌，獲得外毒素基因缺失并對(duì)卡那霉素具有抗性的突變株。電擊轉(zhuǎn)化的電壓設(shè)置為不同的數(shù)值，以期找到最佳的電擊電壓值。

(5)基因敲除突變株的篩選

由于所用的線形打靶DNA中間含卡那霉素(Km)抗性基因，與外毒素基因片段置換后即可整合到宿主菌擬態(tài)弧菌的染色體上表達(dá)卡那霉素抗性，根據(jù)這個(gè)特點(diǎn)，利用選擇培養(yǎng)基篩選外毒素基因敲除的陽(yáng)性突變株。

(6)突變株中抗性基因的剔除

本發(fā)明擬選擇一個(gè)能表達(dá)FLP重組酶的幫助質(zhì)粒pCP20去除卡那霉素(Km)抗性基因，F(xiàn)LP重組酶作用于卡那霉素(Km)抗性基因兩端的FRT位點(diǎn)，通過(guò)重組將卡那霉素(Km)抗性基因剔除。幫助質(zhì)粒pCP20和輔助質(zhì)粒pKD20一樣，都屬于溫度敏感性復(fù)制子，37℃生長(zhǎng)時(shí)就能輕易從宿主中消除。

(7)減毒活疫苗的制備

FLP/FRT系統(tǒng)對(duì)抗性基因的剔除有可能只發(fā)生在部分突變株中，因此，需要進(jìn)一步篩選抗性基因已剔除的突變株。本發(fā)明擬采用平板影印接種法(replicaplating)進(jìn)行不含抗性基因的突變株篩選。篩選出的不含抗性基因的突變株即為減毒活疫苗。

本發(fā)明減毒活疫苗可以用于免疫海水養(yǎng)殖魚類或提高養(yǎng)殖產(chǎn)量。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：