[發(fā)明專利]一種抗弧菌病的減毒活疫苗及其制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010260094.8
• 申請日: 2010-08-20
• 公開（公告）號: CN101926986A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳后波;蘇曉波
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院南海海洋研究所
• 主分類號: A61K39/106
• 分類號: A61K39/106;C12N15/11;C12N1/21;A61P31/04;C12R1/63
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

1.一種抗弧菌病的減毒活疫苗的制備方法，其特征在于所述方法包括線形打靶DNA的設(shè)計和制備、含Red系統(tǒng)的宿主菌擬態(tài)弧菌的構(gòu)建、電擊感受態(tài)擬態(tài)弧菌的制備、電擊轉(zhuǎn)化、基因敲除突變株的篩選、突變株中抗性基因的剔除和制備減毒活疫苗；其中，所述線形打靶DNA的設(shè)計和制備是：設(shè)計一對引物，引物序列如SEQ?ID?NO：1～2所示，一條引物5’末端的40～50bp與外毒素基因5’端同源3’端與卡那霉素抗性基因的一端同源；另一條引物5’末端的40～50bp與外毒素基因3’端同源，3’端與卡那霉素抗性基因的另一端同源；以含卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增出中間未卡那霉素抗性基因、兩端為40～50bp外毒素基因同源臂且含有FRT位點的線形打靶DNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗弧菌病的減毒活疫苗的制備方法，其特征在于所述含Red系統(tǒng)的宿主菌擬態(tài)弧菌的構(gòu)建是將含有Red系統(tǒng)3個基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌擬態(tài)弧菌中，通過調(diào)節(jié)溫度和加入誘導(dǎo)劑來控制Red系統(tǒng)的表達(dá)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗弧菌病的減毒活疫苗的制備方法，其特征在于所述質(zhì)粒為pKD20。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗弧菌病的減毒活疫苗的制備方法，其特征在于所述電擊感受態(tài)擬態(tài)弧菌的制備方法是將含Red系統(tǒng)的宿主菌擬態(tài)弧菌培養(yǎng)過夜，再將隔夜培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接到含卡那霉素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，在終止前加入L-阿拉伯糖來誘導(dǎo)Red系統(tǒng)的表達(dá)，離心收集菌體，制成所需的電擊感受態(tài)菌體。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗弧菌病的減毒活疫苗的制備方法，其特征在于所述電擊轉(zhuǎn)化是利用電擊轉(zhuǎn)化的方法將線形打靶DNA轉(zhuǎn)入感受態(tài)擬態(tài)弧菌，獲得外毒素基因缺失并對卡那霉素具有抗性的突變株。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗弧菌病的減毒活疫苗的制備方法，其特征在于所述基因敲除突變株的篩選是利用選擇培養(yǎng)基篩選外毒素基因敲除的陽性突變株。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗弧菌病的減毒活疫苗的制備方法，其特征在于所述突變株中抗性基因的剔除是用表達(dá)FLP重組酶的質(zhì)粒去除卡那霉素抗性基因。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗弧菌病的減毒活疫苗的制備方法，其特征在于所述制備減毒活疫苗是用平板影印接種法進行不含抗性基因的突變株篩選，篩選出的不含抗性基因的突變株即為減毒活疫苗。

9.一種抗弧菌病的減毒活疫苗，其特征在于所述疫苗通過權(quán)利要求1～8中任意一條權(quán)利要求所述制備方法制得。

10.權(quán)利要求9所述抗弧菌病的減毒活疫苗在免疫海水養(yǎng)殖魚類或提高養(yǎng)殖產(chǎn)量中的應(yīng)用。